Epidémiologie des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline

 Caractères biochimiques

Permettant la différence avec les autres espèces La différenciation des espèces staphylococciques repose sur l’hybridation des acides nucléiques et particulièrement sur l’analyse des séquences de l’ARNr 16S et d’autres techniques de biologie moléculaire. Les S. aureus peuvent se distinguer des autres espèces de staphylocoques par rapport à plusieurs critères distinctifs. Les S. aureus possèdent une coagulase, une désoxyribonucléase (DNase), une activité catalase positive et peuvent fermenter le mannitol.  La coagulase ou staphylocoagulase La staphylocoagulase libre est le produit du gène coa. Ce gène induit la production d’une protéine extracellulaire et non d’une enzyme. Elle fait partie des SERAM (“Secretable Expanded Repertoire Adhesive Molecules”) qui sont des nouvelles adhésines [11]. La coagulase est une protéine de 60 kDa qui se fixe avec la prothrombine sur un site de liaison situé en N-terminal. 9 Elle forme avec la prothrombine un complexe nommé staphylothrombine. Ce complexe va induire une polymérisation du fibrinogène en fibrine et ainsi la formation d’un thrombus [48]. On utilise le test de la coagulase en tube comme marqueur de l’identification de S. aureus en routine dans les services de biologie. Ce test consiste à incuber à 37°C, un mélange de la souche à tester (0,5 ml) et du plasma de lapin (0,5 ml) pendant 4h puis 24h. Si la bactérie possède une coagulase, alors on voit apparaitre un caillot en inclinant le tube. Le plasma de lapin est resté pris en masse au fond du tube (figure 2). Figure 2 : Test de la coagulase en tube [58]. Des chercheurs ont montré que la virulence de S. aureus n’était pas forcément liée au rôle de la coagulase [6], néanmoins la recherche de coagulase permet de différencier les souches potentiellement pathogènes. Enfin on peut considérer que le rôle de la coagulase permet aux souches de S. aureus de résister aux anticorps et à la phagocytose par les leucocytes lorsqu’ils sont localisés dans un caillot.  La DNase thermostable La DNase thermostable est le produit du gène nuc. On la nomme aussi la thermonucléase et c’est une endonucléase. Cette enzyme coupe les acides désoxyribonucléiques (ADN) en nucléotides ou polynucléotides en hydrolysant les liaisons phosphodiesters. La thermonucléase est caractéristique des souches de S. aureus (ainsi que deux autres staphylocoques à coagulase positive) et elle n’est pas détruite à des températures élevées (15 minutes à 100°C). La recherche de cette enzyme se fait sur un milieu ADN-bleu de toluidine et les souches qui possèdent une DNase thermostable forment une zone de couleur rose supérieure à 1 mm, ce qu’on obtient avec S. aureus [21] (figure 3). Figure 3 : Mise en évidence de souche de S. aureus grâce à la DNase thermostable.La catalase Le S. aureus possède une activité catalase positive comme tous les staphylocoques. Cette activité enzymatique permet la dégradation du peroxyde d’hydrogène en eau et dioxygène. Pour réaliser ce test, il suffit de prélever quelques colonies de bactéries et de les mettre en présence de peroxyde d’oxygène (ou eau oxygénée). La présence de bulles de dioxygène confirme l’activité enzymatique de la bactérie (figure 4). La catalase est très utile en pratique pour différencier les bactéries à Gram (+). Figure 4 : Test de la catalase avec présence de S. aureus [18].  La fermentation du mannitol Le S. aureus est capable de fermenter le mannitol. Le mannitol est un polyol et on peut le retrouver comme édulcorant ou bien comme excipient dans les médicaments. Généralement on détecte la fermentation du mannitol par un changement de couleur du milieu de culture. Par exemple pour le milieu BD Mannitol Salt Agar, le milieu passe de la couleur rouge à la couleur jaune s’il y 12 a fermentation du mannitol (figure 5). Ce changement de couleur se produit grâce à un indicateur coloré, dans cet exemple, l’indicateur est le rouge de phénol. Cependant, certaines souches de staphylocoques à coagulase négative fermentent également le mannitol. Figure 5 : Fermentation du mannitol par des souches de S. aureus .

Facteurs de virulence

Caractères antigéniques

Certains antigènes des staphylocoques sont utilisés comme critères de classification et/ou de diagnostic au laboratoire. D’autres jouent un rôle dans la physiopathologie des staphylococcies.  Protéine A Très antigénique, de poids moléculaire 42 kDa, elle est constitutive de la paroi de S. aureus où elle est associée au peptidoglycane. La protéine A est présente uniquement chez les souches humaines de S. aureus. C’est un facteur de virulence en ce qu’elle empêche la phagocytose et permet la colonisation et l’invasion des tissus. Cet antigène est un élément clé du diagnostic bactériologique. Pour cela, on exploite sa propriété à fixer le fragment Fc des 13 immunoglobulines de l’homme et du lapin. La technique de détection consiste à rechercher l’agglutination sur lame des staphylocoques dorés en présence d’hématies de mouton sensibilisées par du sérum de lapin anti-hématies de mouton. On peut remplacer les hématies par des particules de latex recouvertes d’immunoglobulines.  Acides teichoïques Ils sont antigéniques et liés de façon covalente au peptidoglycane. Les acides teichoïques interviennent dans la physiopathologie des staphylococcies en entraînant la nécrose cellulaire, la fièvre, la thrombopénie et la sécrétion de cytokines par les lymphocytes et les monocytes. Peu toxiques, ces antigènes induisent la formation d’anticorps protecteurs dont le dosage dans le sérum peut être utilisé comme test diagnostic.  Polysaccharides de surface Ce sont les antigènes de la capsule dont certains, en empêchant l’activation du complément, protègent S. aureus contre la phagocytose et l’action bactéricide du sérum. Ils permettent la classification du staphylocoque doré en 8 types capsulaires dont le 5 et le 8 représentent 70-80% des souches responsables de septicémies.  Peptidoglycane Le di-aminoacide présent est la L-lysine. La lysostaphine est une endopeptidase qui clive la liaison glycyl-glycine du pont inter peptidique. Le lysozyme est peu actif.

Substances élaborée

s Toutes les souches de S. aureus produisent des protéines excrétées dans le milieu extracellulaire et sont douées soit d’une activité enzymatique, soit d’une activité toxique; mais la distinction entre ces deux formes d’activité biologique est souvent difficile [60]. De même, le caractère extracellulaire de ces substances n’est pas toujours respecté, certaines d’entre elles restent fixées à la membrane cytoplasmique [52].  Enzymes staphylococciques  Coagulase libre La sécrétion de la coagulase est le caractère taxonomique essentiel de l’espèce [33]. La présence de cette enzyme définit l’espèce S. aureus [26, 30]. C’est une enzyme extracellulaire, thermostable peu antigénique. Néanmoins, elle entraîne l’apparition d’anticorps inhibant son activité biologique, ils sont généralement présents dans le sérum des sujets sains [52]. Elle est capable de coaguler en quelques heures le plasma humain (ou de lapin) prélevé sur héparine, oxalate ou EDTA [46]. Cette protéine est d’origine chromosomique. Elle est produite pendant la phase exponentielle de croissance du germe. Sa synthèse nécessite la présence d’acide glutamique, d’histidine et de lysine [52]. Son PM (Poids Moléculaire) varie selon les souches de 31 à 58 kDa et son pI (point Isoélectrique) est de 5,5. Sa formation ne nécessite pas la présence de calcium. Elle n’est pas activée par le fibrinogène purifié. Pour agir, elle a besoin d’une globuline plasmatique voisine ou analogue à la prothrombine (“Coagulase Reacting Factor”) [4, 52]. Il semble que la présence de cette enzyme soit liée à la capacité de S. aureus à provoquer l’infection, elle joue certainement un rôle important dans le pouvoir pathogène [52], elle recouvre les corps bactériens d’une coque de fibrine, ce qui les protège et inhibe leur phagocytose et favorise leur dissémination.