Epidémiologie des intégrons de résistance

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Population d’étude

Elle concernait les enfants de moins de 5 ans hospitalisés ou consultant dans les différents services de pédiatrie participant à cette étude.
– Critères d’inclusion
Pour les formes invasives, l’inclusion concernait les enfants hospitalisés dans les services de pédiatrie d’Albert Royer suspectés d’infection invasive à pneumocoque à type de méningite, de septicémie ou de pneumopathie avec hémoculture positive. Pour le portage rhinopharyngé, l’inclusion concernait les enfants sains consultant pour la vaccination dans les dispensaires de Medina et de Saint-Martin. Avant toute inclusion dans l’étude, les tuteurs légaux de l’enfant doivent signer un consentement éclairé. Dans les deux études, une fiche de renseignement était remplie.
– Critères d’exclusion
Pour les formes invasives, tout enfant n’ayant pas une preuve biologique d’infection pneumococcique était exclu. Pour le portage rhinopharyngé, la présence de signes cliniques de maladie chez l’enfant constituait un critère d’exclusion.

Culture bactériologique

Echantillons prélevés

Le prélèvement rhinopharyngé a été effectué dans des conditions d’asepsie totale à l’aide d’un écouvillon spécial en alginate de calcium muni d’une tige flexible en aluminium mis en contact avec le nasopharynx. Après prélèvement, l’écouvillon était conservé dans un bouillon cœur cervelle (BCC) puis mis en culture sur gélose au sang au laboratoire de Biologie Médicale de l’Institut Pasteur de Dakar. Pour les formes invasives, les prélèvements étaient effectués en milieu hospitalier. Il s’agissait de liquides de ponction (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural, liquide d’ascite, liquide articulaire), d’hémocultures et de sécrétions respiratoires. Les prélèvements étaient pris en charge au niveau du laboratoire d’Albert Royer de Fann. Isolement et identification En cas d’isolement de pneumocoque, la souche était acheminée au laboratoire de Biologie Médicale de l’Institut Pasteur de Dakar. Les échantillons étaient ensemencés sur une gélose au sang de mouton incubée à 35-37°C, en atmosphère enrichie en CO2 (5%), pendant 24 à 48H. Les prélèvements rhinopharyngés placés dans un bouillon BCC étaient ensemencés sur une gélose Columbia ANC avec 5% de sang de cheval contenant un disque d’optochine incubée à 35-37°C, en atmosphère enrichie de 5% de CO2, pendant 24 à 48H.
S. pneumoniae était identifiée suivant les méthodes bactériologiques classiques. Les colonies alpha hémolytiques présentant une zone d’inhibition (diamètre > 14 mm) faisaient l’objet de tests additionnels tels que la coloration de Gram (diplocoque à Gram positif), la réaction de catalase (négative) et l’agglutination au latex (Slidex Pneumo-Kit®, bioMérieux) qui est positive avec les souches capsulées au contact des anticorps. Les souches de pneumocoque étaient ensuite conservées à -80°C dans un milieu trypticase-soja additionné de lait écrémé.

Sérogroupage des souches

Le sérogroupage des souches de pneumocoque a été réalisée avec la technique de référence dite de « gonflement capsulaire ou Quellung reaction ». Le type de capsule était déterminé pour 23 différents sérogroupes par l’agglutination au latex (Pneumotest kit, Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark) selon les recommandations du fournisseur. La reconnaissance de l’antigène capsulaire (type) par l’anticorps en suspension (testé) se traduit par une agglutination des bactéries visible au microscope, ainsi que par l’immuno-précipitation de la capsule entraînant une augmentation de sa réfringence. A partir d’une culture pure de 18h à 24h sur gélose au sang de mouton, on prélève à l’oëse un grand nombre de colonies qui sont ensuite mises en suspension dans environ 650 µl d’eau distillée stérile contenue dans un tube de 5 ml (la turbidité de l’eau doit être bien visible). On dépose ensuite sur une lame de verre, 3 µl de « factor sera » puis 5 µl de suspension bactérienne, après mélange par aspiration-refoulement, on recouvre avec une lamelle et on observe au microscope (objectif x40 ou x100 à immersion). Une réaction positive se développe en moins de 1 min et se traduit par une agglutination des bactéries (formation d’amas), et par une augmentation de la réfringence de la paroi bactérienne (due à l’immuno-précipitation). Pour les souches dont le sérogroupe comprend des sérotypes inclus dans le vaccin à 7 valences (Prevenar ), c’est-à-dire les sérogroupes 6, 9, 18, 19 et 23 ; un sérotypage sera effectué à partir de la même suspension bactérienne et selon le même protocole que le sérogroupage avec des sérums monovalents permettant d’identifier les sérotypes 6A, 6B, 9V, etc. Dans le cas où aucun antisérum ne permet d’agglutiner ou augmenter la réfringence de la capsule, un repiquage de quelques colonies était réalisé sur une gélose au sang incubée ensuite 18 à 24h à 37°C en anaérobiose afin de favoriser la production de capsule par la bactérie. Si aucune réaction d’agglutination n’était obtenue après cette étape, la souche était alors considérée comme « non groupable (NG) ».

Antibiogramme

Un antibiogramme était réalisé par la méthode de diffusion en milieu gélosé pour étudier la sensibilité des β-lactamines et des fluoroquinolones selon les recommandations du CA-SFM. A partir d’une culture pure de 24h sur gélose au sang de mouton, une suspension bactérienne équivalente à 0,5 McFarland (~108 UFC/ml) était préparée en solution saline (0,9 % NaCl). Une dilution au 1/10 (~ 107 UFC/ml) de l’inoculum était ensuite ensemencée par écouvillonnage. Les disques d’antibiotiques étaient ensuite déposés sur la gélose au sang préalablement séchée. Les diamètres d’inhibition étaient lus après 24h d’incubation à 35-37°C, sous 5 à 10% de CO2. L’interprétation des résultats de l’antibiogramme était réalisée suivant les règles du CA-SFM. Le disque d’oxacilline à 5µg a été utilisé pour la détection de la sensibilité à la pénicilline. Les souches ayant un diamètre de l’oxacilline < 26 mm étaient considérées comme étant de sensibilité diminuée
à la pénicilline G. Pour ces souches, les CMI de la pénicilline G, de l’amoxicilline et du céfotaxime étaient mesurées. Les CMI des fluoroquinolones étaient également déterminées pour les souches ayant un diamètre d’inhibition < 10 mm, < 17 mm et < 19 mm respectivement pour la norfloxacine, la lévofloxacine, et la ciprofloxacine.

Détermination des CMI

Les solutions mères des antibiotiques testés sont préparées à l’avance. Pour chaque antibiotique, une série de dilutions au dixième est effectuée. Les milieux de culture sont préparés à partir de la gélose MH additionnée de sang de mouton dans laquelle on incorpore la dilution d’antibiotique. Les souches à tester sont ensuite ensemencées sur ces différents milieux gélosés de concentrations croissantes. La lecture se fait après 18 à 24h d’incubation. Des souches de référence ont été utilisées pour valider les résultats. Pour les β-lactamines, si la CMI de la pénicilline G était supérieure à 0,0612 mg/l, alors la CMI à l’amoxicilline était déterminée, et si cette dernière était supérieure à 0,5 mg/l, la CMI de la céfotaxime était enfin mesurée. Les CMI de la norfloxacine, lévofloxacine, moxifloxacine, ciprofloxacine étaient aussi déterminées.

Analyse statistique des données

Les données ont été saisies dans Access. L’analyse des données a été effectuée au moyen du logiciel STATA. Les pourcentages ont été calculés avec un intervalle de confiance (CI) de 95%, lorsqu’ils étaient significatifs. Les valeurs de l’âge moyen et du sex ratio étaient estimées chez les enfants inclus dans les études de portage et d’infection invasive.

Table des matières

Introduction générale
Première partie : Revue de la littérature
I. Streptococcus pneumoniae
I.1. La bactérie
I.1.1. Historique
I.1.2. Taxonomie
I.1.3. Caractères bactériologiques de Streptococcus pneumoniae
I.2. Epidémiologie
I.3. Facteurs de virulence de Streptococcus pneumoniae
I.3.1. La capsule
I.3.2. La pneumolysine
I.3.3. Les protéines à motif LPxTG
I.3.4. Les protéines liées à la choline (CBPs : Choline Binding Proteins)
I.3.5. Protéines de surface PspA et PspC
I.3.6. Les pili
I.4. Pathologies associées à l’infection au pneumocoque
I.5. Diagnostic bactériologique
I.6. Traitement
I.6.1. Curatif
I.6.2. Vaccination
I.6.2.1. Vaccin polysaccharide (VP)
I.6.2.2. Vaccin polysaccharide conjugué (VPC)
I.6.2.3. Emergence de sérotypes non vaccinaux
II. Legionella pneumophila
II.1. Considérations taxonomiques
II.2. Caractères bactériologiques de L. pneumophila
II.3. Ecologie de L. pneumophila
II.4. Epidémiologie de L. pneumophila
II.4.1. Modes de transmission et facteurs de risque
II.4.2. Sources de contamination
II.4.3. Contamination humaine
II.4.4. Contamination hydrique
II.5. Facteurs de virulence de L. pneumophila
II.5.1. Système de sécrétion de type IV
II.5.2. Système de sécrétion Lsp de type II
II.5.3. Capacité de différenciation de L. pneumophila
II.5.4. La réponse stringente de L. pneumophila
II.5.5. Rôle du système de sécrétion de type II
II.5.6. Métabolisme du fer chez Legionella pneumophila
II.5.6.1. Production de la légiobactine
II.5.6.2. Voie codée par iraA et iraB
II.5.6.3. Voie utilisant la maturation du cytochrome c
II.5.6.4. Acquisition du fer par la pyomélanine
II.6. La Légionellose
II.6.1. Formes cliniques
II.6.2. Diagnostic bactériologique
II.6.3. Traitement
II.6.3.1. Traitement curatif
II.6.3.2. Mesures de désinfection des milieux contaminés
II.6.4. Prévention de la contamination hydrique
II.6.5. Surveillance épidémiologique
III. BGN responsables d’infection respiratoire nosocomiale
III.1. Klebsiella pneumoniae
III.1.1. Taxonomie
III.1.2. Caractères bactériologiques
III.1.3. Habitat et épidémiologie
III.1.4. Facteurs de pathogénicité
III.1.4.1. Antigènes de surface
III.1.4.2. Adhésines
III.1.4.3. Sidérophores
III.1.4.4. Îlot de pathogénicité (HPI)
III.1.4.5. Elément d’intégration et de conjugaison (ICE)
III.1.4.6. Autres gènes de virulence
III.1.5. Infections à K pneumoniae
III.2. Enterobacter aerogenes
III.2.1. Taxonomie
III.2.2. Caractères bactériologiques
III.2.3. Habitat et épidémiologie
III.2.4. Facteurs de pathogénicité
III.2.5. Infections à E. aerogenes
III.3. Pseudomonas
III.3.1. Taxonomie
III.3.2. Caractères bactériologiques
III.3.3. Habitat et épidémiologie
III.3.4. Facteurs de pathogénicité
III.3.4.1. Facteurs membranaires
III.3.4.1.1. Le flagelle
III.3.4.1.2. Les pili de type IV
III.3.4.1.3. Facteur d’attachement de type fimbriae
III.3.4.1.4. Le Lipopolysaccharide (LPS)
III.3.4.2. Facteurs impliqués dans la colonisation de l’hôte
III.3.4.2.1. Quorum sensing
III.3.4.2.2. L’exotoxine A
III.3.4.2.3. L’élastase
III.3.4.2.4. Les Phospholipases C
III.3.4.2.5. Les Rhamnolipides
III .3.4.2.6. Les Chromophores
III.3.4.2.7. Protéase alcaline
III.3.4.2.8. Protéase IV
III.3.4.3. Le système de sécrétion de type 3 (T3SS) et ses
III.3.4.4. Les lectines solubles
III.3.4.5. Facteurs de virulence impliqués dans l’infection
I.3.4.5.1. L’acquisition du fer
I.3.4.5.2. Les alginates et la formation de biofilm
III.3.5. Infections à Pseudomonas
IV. Résistance aux antibiotiques des BGN
IV.1. Mécanismes de résistance
IV.2. Les β-lactamases
IV.2.1. Classification des β-lactamases
IV.2.2. Les β-lactamases à spectre étendu (BLSE)
IV.2.3. Les Carbapénémases
IV.3. Résistances aux quinolones des BGN
IV.3.1. Résistances chromosomiques
IV.3.1.1. Modification de la cible enzymatique des fluoroquinolones
IV.3.1.2. Diminution de la concentration intracellulaire
IV.3.1.2.1. Réduction de la perméabilité
IV.3.1.2.2. Pompes à efflux
IV.3.2. Résistances plasmidiques
IV.3.2.1. Les protéines Qnr
IV.3.2.2. Le mécanisme aac(6’)- Ib-cr
IV.3.2.3. Les pompes à efflux plasmidiques
IV.3.2.3.1. La pompe à efflux QepA
IV.3.2.3.2. La pompe à efflux OqxAB
V. Supports génétiques de la résistance
V.1. Les plasmides
V.2. Les séquences d’insertion
V.3. Les éléments transposables
V.4. Intégrons de résistance
V.4.1. Définition et origines
V.4.2. Structure
V.4.3. Classes d’intégron
V.4.4. Epidémiologie des intégrons de résistance
V.4.5. Bactéries hôtes
V.4.6. Cassettes
V.4.6.1. Structure
V.4.6.2. Fonction des cassettes
V.4.6.3. Intégration et mobilité de cassettes
V.4.6.4. Expression des cassettes
Deuxième Partie : Travaux de thèse
Présentation du travail de thèse
Publication n°1: Identifying an appropriate PCV for use in Senegal, recent insights concerning Streptococcus pneumoniae NP carriage and IPD in Dakar. Article en préparation pour soumission à PLoS One) : Mécanismes moléculaires de la résistance aux antibiotiques des souches d’entérobactéries et de Pseudomonas spp isolées,d’infections respiratoires chez des patients Sénégalais.
Publication n°2 : Evaluation du niveau de contamination par les légionelles du réseau de distribution d’eau d’hôpitaux et hôtels de Dakar.
Discussion générale et Perspectives
Références bibliographiques
Publication complémentaire