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Xylanase multimodulaire
Nous avons choisi de travailler avec une xylanase (Chapitre 1. 10. I) c‟est pourquoi cette sous-partie traite plus particulièrement des enzymes multimodulaires contenant un module catalytique xylanase et un CBM. La présence d‟un CBM pourrait augmenter la dégradation d‟un substrat, selon la nature et les propriétés du module catalytique et du CBM. Par exemple, l‟équipe de Moraïs a permis de comparer des enzymes sur des xylanes purifiés (de glumes d‟avoine, de hêtre ou de bouleau) (Moraïs et al., 2010b). L‟enzyme multimodulaire est composée du module catalytique de la xylanase Xyn11A de Thermobifida fusca et d‟un CBM de la famille 2, spécifique des xylanes et de la cellulose. Ces deux modules ou seulement le module catalytique sont liés à une dockérine (car l‟objectif de cette recherche est de créer des cellulosomes artificiels). La construction avec le CBM est celle qui a une activité spécifique (AS) la plus élevée sur les trois substrats. Par exemple sur le xylane de hêtre, l‟AS pour la construction « xylanase + dockérine » est égale à 345 katal.mol-1 alors qu‟en présence du CBM c‟est-à-dire pour la construction « xylanase + CBM + dockérine », l‟AS est égale à 445 katal.mol-1. Le CBM a donc un rôle important sur ces substrats purifiés. Les deux constructions de la xylanase sont ensuite testées avec une autre xylanase produite par T. fusca nommée Xyn10B sur de la paille de blé hachée. Lorsque la construction avec le module catalytique de Xyn11A et le module dockérine est mélangée à Xyn10B, l‟AS est inférieure à celle du mélange de Xyn10B avec la construction « xylanase Xyn11A + CBM + dockérine ». Dans ce deuxième cas, le CBM permet d‟augmenter l‟action de l‟enzyme.
D‟autres études ont été réalisées avec une xylanase et un ou plusieurs CBMs mais en étudiant seulement l‟affinité avec le ligand. On peut citer l‟étude d‟une xylanase (xylanase A de Clostridium stercorarium) naturellement associée à deux CBMs, pouvant reconnaitre la cellulose ou le xylane de glumes d‟avoine (Sun et al., 1998). L‟adsorption a été mesurée pour les différentes constructions sur de la cellulose (ASC). La protéine entière s‟adsorbe à 90 % alors que la construction sans le CBM initialement en position N-terminale (XynAΔC) ne s‟adsorbe qu‟à 6 %. Le CBM est donc indispensable pour reconnaitre ce ligand. Lorsque le test est réalisé avec un autre ligand, le xylane de glumes d‟avoine, la conclusion est identique. En effet, la construction sauvage s‟adsorbe à 85 % alors que XynAΔC s‟adsorbe à 7 %.
Ces études ont montré l‟importance de l‟ajout d‟un CBM pour dégrader différents substrats ou augmenter la reconnaissance de ligands (xylane ou paille de blé hachée). Cependant, à ma connaissance une seule étude a utilisé un substrat complexe tel que la paille de blé, sous forme hachée (Moraïs et al., 2010b).
Enzyme multimodulaire avec le CBM3a
Nous avons choisi de travailler avec le CBM3a de la protéine CipA de C. thermocellum (Tormo et al., 1996) car ce CBM3a reconnait fortement la cellulose. Ainsi, l‟association entre l‟endoglucanase de Alicyclobacillus acidocaldrious et plusieurs CBMs dont le CBM3a de la protéine CipA de C. thermocelllum a été réalisée (Telke et al., 2012). L‟AS de chaque construction a été déterminée sur différents substrats solubles contenant de la cellulose et des substrats insolubles cellulosiques comme l‟Avicel et le papier filtre. La présence du CBM3a a fait augmenter l‟AS d‟un facteur 12,5 pour l‟Avicel et d‟un facteur 10 pour le papier filtre par rapport à l‟endoglucanase seule. La liaison avec l‟Avicel est le deuxième paramètre déterminé. Seulement 5 % de l‟enzyme sauvage sont liés au ligand alors que 50 % de l‟endoglucanase associée au CBM3a sont fixés sur ce ligand.
Ces données peuvent être nuancées car il a été montré à plusieurs reprises que l‟ajout d‟un CBM ne favorise pas toujours l‟action du module catalytique. Ainsi, la xylanase D de C. fimi a été étudiée. Il s‟agit d‟une enzyme multimodulaire avec un CBM en interne qui reconnait les xylanes alors que le deuxième CBM, placé en C-terminal est spécifique de la cellulose (Black et al., 1995). L‟AS pour la protéine sauvage, pour le domaine catalytique seul ou pour le domaine catalytique associé au CBM interne a été déterminée sur du xylane soluble de glumes d‟avoine. L‟AS est la plus importante pour le domaine catalytique seul (693 unités/ mg d‟enzyme) puis pour l‟enzyme entière (678 unités/ mg d‟enzyme) et pour le domaine associé au CBM (652 unités/mg d‟enzyme). La présence du CBM n‟améliore pas l‟activité sur ce substrat. Une autre étude a montré que la présence du CBM entrainait une diminution de l‟activité de la xylanase. En effet, Inoue et ses collègues ont travaillé avec la xylanase de Talaromyces cellulolyticus (GH10) qui est une enzyme multimodulaire avec le domaine catalytique et un CBM de la famille 1 (dont le ligand hypothétique est de la cellulose ) (Inoue et al., 2015). L‟activité sur de l‟arabinoxylane de blé a été déterminée pour l‟enzyme entière (21,9 U.nmol-1) et pour le domaine catalytique seul (35,5 U.nmol-1). Ainsi, l‟activité est plus faible lorsque le module catalytique est associé à ce CBM.
A partir des données actuelles, il semble difficile de prédire si l‟association entre le CBM3a et un domaine catalytique est intéressante pour augmenter l‟activité catalytique.
Enzyme multimodulaire avec plusieurs CBMs
Les CBMs présents dans une enzyme multimodulaire peuvent être des membres de différentes familles qui ciblent des ligands variés (Araki et al., 2004; Hogg et al., 2003). Parmi les premiers CBMs en tandem découverts, il y a ceux associés à la xylanase 11A de C. fimi (Bolam et al., 2001). Ces deux CBMs étaient de la famille 2b. Plusieurs CBMs peuvent agir en synergie pour lier leur ligand cible. L‟équipe de Linder (Linder et al., 1996) a montré une coopération dans une protéine artificielle contenant deux CBM1 liés de manière covalente. Cette protéine artificielle a une affinité pour la cellulose insoluble augmentée de 6 à 10 fois par rapport aux modules seuls. Le modèle proposé est que la liaison entre un CBM1 et le polysaccharide insoluble augmente l‟affinité du deuxième module pour le ligand grâce à un effet de proximité. Ceci accroît l‟affinité générale de la protéine. Ce modèle est aussi possible dans le cas de polysaccharides solubles. Un autre exemple de synergie entre CBMs de même famille provient de l‟étude de Freelove et ses collaborateurs sur deux CBMs de famille 29 avec une affinité augmentée de 4 à 45 fois par rapport à un seul des CBMs (Freelove et al., 2001). Les informations obtenues par ces équipes suggèrent que les GHs associées à plusieurs CBMs ont une affinité plus importante pour les polysaccharides insolubles grâce aux interactions coopératives de ces modules (Bolam et al., 2001; Freelove et al., 2001; Linder et al., 1996). Ceci n‟est pourtant pas un cas général (Abou Hachem et al., 2000; Gill et al., 1999; Hervé et al., 2010; Tomme et al., 1996). En conséquence, à chaque association entre une GH et plusieurs CBMs, l‟enzyme multimodulaire doit être caractérisée.
Une autre raison possible à la présence de plusieurs CBMs est de diversifier les polysaccharides qui vont interagir avec l‟enzyme et donc de dégrader différentes cibles de la paroi cellulaire (Blake et al., 2006). En effet, la présence de CBMs avec des spécificités différentes peut emmener l‟enzyme vers plusieurs ligands potentiels. Pour rappel, la xylanase Xyn11A de C. fimi a un CBM interne (CBM2b1) et un CBM en C-terminal (CBM2b2). La xylanase entière se lie à la cellulose insoluble et aux xylanes insolubles alors que la forme sans le CBM2b2 peut interagir avec les xylanes mais n‟a pas d‟affinité pour la cellulose (Black et al., 1995). Le CBM2b1 interne interagit avec les xylanes mais n‟a pas d‟affinité significative pour la cellulose (Black et al., 1995; Simpson et al., 2000). La nature du polysaccharide ne serait pas le seul facteur important, il faudrait également prendre en compte l‟environnement dans lequel il se trouve (la nature et les substitutions des polysaccharides par exemple) (Bolam et al., 2004; Hogg et al., 2003; Zhang et al., 2014).
Importance du linker dans une enzyme multimodulaire
Un linker est souvent présent entre un domaine catalytique et un domaine non catalytique comme un CBM ou un module dockérine. Ce linker est riche en glycine et parfois en proline dans les chitinases de plante (Raikhel et al., 1993), riche en proline, thréonine et sérine dans les cellulases fongiques (Abuja et al., 1988; Tomme et al., 1988) ou dans les cellulases bactériennes (Langsford et al., 1987; Warren et al., 1986). Après l‟étude de plusieurs banques de linkers, il apparait que les résidus de thréonine, de glutamine et de proline sont les résidus majoritaires (Argos, 1990; George and Heringa, 2003). Cependant, les deux études ont mis en évidence d‟autres résidus qui sont variables. La sérine, la glycine, l‟alanine, l‟acide aspartique, la lysine et l‟asparagine sont des résidus importants d‟après la première étude (Argos, 1990) alors que la deuxième étude a souligné l‟intérêt des résidus de phénylalanine, d‟arginine et d‟acide glutamique (George and Heringa, 2003). Ceci fait ressortir la complexité des linkers.
Table des matières
Résumé
Abstract
Remerciements
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction générale
Chapitre 1 : Etude bibliographique
1. La biomasse lignocellulosique
I. La structure de la paroi
a) Généralités
b) Les parois primaires et secondaires
II. Composition de la paroi
2. Composition des Poaceae
I. La cellulose
II. Les hémicelluloses
III. Les pectines
IV. Les lignines
V. Les protéines
VI. Interactions entre les composés de la paroi
3. Enzymes impliquées dans la déconstruction de la biomasse lignocellulosique
I. Les glycosides hydrolases
II. Le site actif des glycosides hydrolases
III. Les mécanismes d‟action
4. Cellulases
I. Généralités sur les cellulases
II. Structure des cellulases
5. Xylanases
I. Généralités sur les xylanases
II. Structure des xylanases
III. Etude des xylanases
6. Xylosidase
I. Généralités sur les xylosidases
II. Structure des xylosidases
7. Les principales enzymes débranchantes
8. Les carbohydrate estérases
I. Féruloyle estérase
II. Acétyle xylane estérase
9. Les CarbohydrateBinding Modules
I. Généralités sur les CBMs
II. Structure des CBMs
a) Classement des CBMs
b) Repliement des CBMs
III. Fonctions des CBMs
10. Protéines mises en oeuvre dans cette thèse
I. NpXyn11A de Neocallimastix patriciarum
II. Les CEs
a) Les enzymes E5UNK, E7 et E8
b) Les enzymes Pm13, Pm20 et Pm51
III. CBMs
a) Le CBM2b1 de la xylanase 11A de Cellulomonas fimi
b) Le CBM3a de Clostridium thermocellum
11. Les différentes stratégies de dégradation de la lignocellulose
I. Enzymes sécrétées
II. Cellulosome
a) Généralités sur les cellulosomes.
b) Mimer la nature : les protéines Jo et In
III. Synergie et proximité entre enzymes
a) Synergie entre enzymes
(1) Généralités
(2) Synergie entre une xylanase et une CE
b) Enzyme multimodulaire
(1) Xylanase multimodulaire
(2) Enzyme multimodulaire avec le CBM3a
(3) Enzyme multimodulaire avec plusieurs CBMs
(4) Importance du linker dans une enzyme multimodulaire
12. Suivi de l‟hydrolyse d‟un substrat complexe par immunocytochimie
I. Généralités sur l‟immunocytochimie
II. Sonde : anticorps monoclonal ou CBM
III. Exemples d‟utilisation de CBMs en immunocytochimie
IV. Immunocytochimie et suivi d‟hydrolyse d‟un substrat complexe.
13. Problématiques de la thèse
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
1. Biologie moléculaire
I. Plasmides utilisés
a) Liste des plasmides
b) Système pET
II. Milieux de culture
a) Milieux liquides
(1) Lysogeny Broth (LB)
(2) ZYP5052
(3) SOB
b) Milieu solide
III. Préculture
IV. Purification de l‟ADN à partir d‟une préculture
V. Utilisation d‟enzymes de restriction
VI. Préparation d‟un gel d‟agarose
VII. Purification sur gel d‟agarose des fragments d‟ADN
VIII. Ligature d‟un insert dans un vecteur
IX. Amplification des plasmides par PCR
X. Recombinaison homologue d‟ADN
XI. Préparation de cellules compétentes
a) Culture des cellules
b) Vérification de la compétence
XII. Transformation des cellules compétentes
XIII. Dosage de l‟ADN
XIV. Séquençage de l‟ADN
2. Expression de protéine recombinante dans Escherichia coli
I. Cas de la production de protéines
II. Antibiotiques
III. IPTG
3. Purification des protéines
I. Préparation des extraits cellulaires
II. Chromatographie d’affinité d‟ions métalliques immobilisés (IMAC)
a) Cas général
b) IMAC par centrifugation
c) IMAC pour les échantillons de microthermophorèse
III. Séparation de protéines par chromatographie d‟exclusion stérique
IV. Gel d’électrophorèse SDSPAGE
V. Dialyse
a) Boudins à dialyse
b) Colonne de dessalage PD10
VI. Mesure de la concentration en enzyme
a) Mesure de l’absorbance
b) Détermination par gel SDSPAGE
VII. Concentration de protéines
a) Cas classique
b) Cas des CBMs spécifiques de la cellulose
4. Substrats d‟étude
I. Préparations disponibles de cellulose
II. Le blé
a) Vision globale de la plante
b) La paille de blé
c) Le son de blé
5. Biophysique
I. Etude de l‟affinité entre un CBM et un sucre
II. Association entre une protéine et un ligand insoluble
III. Microcalorimétrie
a) CBMligand
(1) Cellulose régénérée
(2) Nanocristaux de cellulose
(3) Arabinoxylanes de blé
b) Protéineprotéine
IV. Résonance magnétique nucléaire
V. Microthermophorèse
a) Marquage de la protéine
b) Analyse par MST
6. Enzymologie
I. Dosage de l‟activité enzymatique sur un substrat chromogénique
a) pNPX3
b) pNPAce
II. Test DNS
a) Préparation du DNS
b) Protocole général
c) Préparation des substrats
(1) Xylane de hêtre
(2) Son de blé
(3) Paille de blé
d) Détermination des paramètres cinétiques
e) Cinétique sur xylane de hêtre
f) Cinétique sur son ou paille de blé
III. Analyse HPAECPAD
a) Protocole général
b) Cinétique sur xylane de hêtre
c) Cinétique sur son ou paille de blé
7. Immunocytochimie
I. Préparation des échantillons
a) Echantillons inclus en paraffine
(1) Fixation
(2) Inclusion dans du Paraplast plus
b) Echantillons inclus dans de la résine
II. Coupe des échantillons
a) Echantillons inclus dans de la paraffine
(1) Traitement des lames
(2) Microtome
(3) Déparaffinage
b) Echantillons inclus dans de la résine
III. Digestion enzymatique
a) Echantillons inclus dans de la paraffine
b) Echantillons inclus dans de la résine
IV. Marquage des coupes
a) Visualisation des xylanes
b) Visualisation de la cellulose
c) Coloration au calcofluor
8. Analyse des coupes de paille de blé
I. Microscopie
II. Quantification de l‟immunofluorescence
9. Modélisation d‟InNpXyn11AJoCBM3a versus données SAXS.
Chapitre 3 : Validation du système JoIn
1. Introduction
2. Résultats
I. Construction des protéines chimériques
a) Construction des plasmides
b) Optimisation des conditions d’expression des protéines
II. Conservation des propriétés physicochimiques des protéines chimériques
a) Association entre Jo et In
b) Paramètres cinétiques de NpXyn11A en fusion avec Jo ou In
c) Capacité de reconnaissance des CBMs—èv
(1) CBM3a
(2) CBM2b1
3. Conclusion
Chapitre 4 : Etude cinétique de l‟influence du CBM3a sur l‟activité de la xylanase
1. Introduction
2. Résultats
I. Couplage des modules protéiques et purification des enzymes multimodulaires
II. Activité des enzymes sur substrat soluble
III. Activité des enzymes sur substrat insoluble
a) Activité des enzymes sur son et paille de blé
b) Comparaison d’In avec un CBM de type B
c) Présence du CBM3a sous forme libre
d) Diffusion et structure des enzymes multimodulaires
3. Conclusion
Chapitre 5 : Etude de l‟activité de NpXyn11A sur des coupes d‟entrenoeud de paille de blé
1. Introduction
2. Résultats
I. Influence de l‟analyse des images dans le traitement des données
II. Effet de la concentration en NpXyn11A sur la détection des xylanes
III. Influence de la dégradation de la cellulose sur la détection des xylanes
IV. Impact de la modularité de NpXyn11A sur la détection des xylanes
a) Effet du module In sur l’activité de NpXyn11A lors de la dégradation des xylanes
b) Effet du CBM3a sur l’activité de NpXyn11A lors de la dégradation des xylanes
3. Conclusion
Chapitre 6 : Perspectives
1. Etude de la synergie d‟action d‟enzymes multicatalytiques.
2. Influence du domaine catalytique sur la reconnaissance du ligand du CBM
3. Etude immunocytochimique sur des sections entière de paille de blé
Conclusion générale
Références bibliographiques.
Annexe 1 : Séquences nucléotidiques et protéiques des différentes protéines
Annexe 2 : Génotype des cellules compétentes utilisées
Annexe 3 : Choix des paramètres des images immunocytochimiques
I. Quantification des images
II. Images proposées dans le manuscrit
