Electrospray Ionisation Mass Spectrometry (ESI-MS)

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Analyse structurale du λ-carraghénane par la λ-carraghénase

INTRODUCTION

Les études menées ces dernières années sur les κ- et ι-carraghénases ont permis d’obtenir des caractérisations relativement complètes de ces enzymes, mais l’activité λ-carraghénase est restée peu exploitée.
L’activité extracellulaire λ-carraghénase a été détectée, pour la première fois, chez P. carrageenovora, en présence de carraghénane non fractionné (Weigl et al., 1966b). Afin de minimiser la production associée de κ-carraghénase, la culture a ensuite été effectuée en présence de λ-carraghénane de C. crispus (Johnston et al., 1973). Après purification partielle de la λ-carraghénase, l’hypothèse d’un complexe enzymatique extracellulaire impliquant trois hydrolases a été avancée (Johnston et al., 1973). Cette hypothèse fut écartée par la purification à l’homogénéité de la λ-carraghénase comme protéine unique de 98 kDa (Greer, 1984; Potin, 1992).
Le séquençage récent de l’enzyme a révélé que la λ-carraghénase ferait partie d’une nouvelle famille de glycoside hydrolase. Elle ne s’apparente ni à la famille 16 de la κ-carraghénase, ni à la famille 82 de la ι-carraghénase (Colin, 2005). Le gène de la λ-carraghénase code une protéine de 942 acides aminés, avec un poids moléculaire de 105 kDa. La surexpression de la λ-carraghénase a abouti à une production de l’enzyme sous forme de corps d’inclusion. Après dénaturation à l’urée 8 M, le repliement de l’enzyme a été possible par dilution rapide mais avec un faible rendement (Colin, 2005).
Les premières mesures biochimiques réalisées avaient montré une activité optimale à pH 6,5 et à 30 °C (Greer, 1984). La λ-carraghénase hydrolyserait spécifiquement les fractions lambda (KCl solubles) de carraghénanes extraits de Gigartinaceae (Johnston et al., 1973) et plus particulièrement les structures π- (G2S-DP2S), ξ-(G2S-D2S) et λ-carraghénanes extraits de formes tétrasporophytes de G. canaliculata, G. pistillata et C. crispus (Greer, 1984). Greer avait donc avancé que la sulfatation en 2 sur l’unité G2S serait nécessaire à la reconnaissance. Les produits limites d’hydrolyse de la λ-carraghénase n’ont pas été caractérisés mais seraient des oligosaccharides de faibles poids moléculaires (Johnston et al., 1973; Greer, 1984).
Des études ont été menées sur les structures de carraghénanes de la famille lambda (λ, ξ, π, θ) présentes dans la paroi des formes tétrasporophytes de nombreuses espèces de Gigartinaceae (McCandless et al., 1983). Ces structures ont été caractérisées principalement par des techniques d’analyses chimiques et spectroscopiques (IR, RMN). L’analyse du λ-carraghénane par RMN est difficilement réalisable à cause de la forte viscosité des solutions. Un spectre 13C-RMN correctement résolu de λ-carraghénane a pu néanmoins être obtenu et assigné (Falshaw et al., 1994; Stortz et al., 1994; van de Velde et al., 2004). L’assignation du spectre 1H-RMN a, par contre, été limitée au proton du carbone anomérique α (Stortz et al., 1994; van de Velde et al., 2004).
Dans ce contexte, nous avons réalisé une étude de l’hydrolyse enzymatique, par la λ-carraghénase, de λ-carraghénanes extraits de Gigartinaceae. La stratégie proposée réside en l’analyse des produits d’hydrolyse, afin de déterminer la structure de ces λ-carraghénanes et de mieux connaître le mode d’action de la λ-carraghénase.
Afin de pouvoir utiliser cette λ-carraghénase comme outil pour l’analyse structurale du λ-carraghénane, il a été nécessaire, dans un premier temps, de compléter les connaissances sur cette enzyme. Les études présentées dans ce chapitre ont été menées sur la λ-carraghénase native de P. carrageenovora, la λ-carraghénase recombinante ne pouvant être, pour l’instant, obtenue en quantité suffisante. Les profils d’hydrolyse enzymatique de ces λ-carraghénanes ont été comparés, et le λ-carraghénane de G. skottsbergii, présentant la structure lambda la plus régulière, a été sélectionné comme substrat d’étude. La formation des oligo-carraghénanes au cours de l’hydrolyse enzymatique du λ-carraghénane de G. skottsbergii a été suivie par différentes méthodes d’analyse. Les oligo-λ-carraghénanes, produits majoritaires de l’hydrolyse enzymatique, ont été purifiés et caractérisés par RMN. Cette caractérisation a permis de corriger les attributions 13C-RMN du polymère λ-carraghénane et d’obtenir les attributions 1H-RMN. La caractérisation d’oligo-λ-carraghénanes hybrides minoritaires au sein des produits d’hydrolyse, a apporté des informations sur la nature et sur les arrangements de ces motifs minoritaires dans la structure lambda majoritaire. Ces études des produits d’hydrolyse ont permis, parallèlement, de déterminer le mode d’action de la λ-carraghénase, son site de coupure, la nature de ses produits limites et sa spécificité.
Le polymère a été préalablement dépolymérisé par broyage. Les 12 signaux caractéristiques du λ-carraghénane sont présents. Les signaux négatifs correspondent aux carbones primaires C6 des G2S et D2S,6S. Le signal du G2S-C6 est particulièrement important comparativement aux autres signaux mais une augmentation du D1 a peu d’impact sur l’importance du signal.

Production et purification de la λ-carraghénase.

La production de λ-carraghénase par la bactérie P. carrageenovora dans le milieu extracellulaire, a été induite par la présence dans le milieu de culture du λ-carraghénane extrait du tétrasporophyte de G. skottsbergii. La purification de la λ-carraghénase a été réalisée en se basant principalement sur les propriétés hydrophobes de l’enzyme, tout d’abord par une précipitation de l’enzyme par saturation au sulfate d’ammonium (30-70%), puis par une purification sur colonne Phenyl Sepharose par gradient décroissant de sulfate d’ammonium. La purification de 5 L de culture nous a permis d’obtenir environ 500 µg de λ-carraghénase pure (gel SDS) à une concentration de 59,1 µg/mL. Son poids moléculaire a été estimé sur gel SDS vers 98 kDa (Figure 24), comme précédemment décrit (Greer, 1984; Potin, 1992).

Choix du substrat d’étude.

Pour étudier les paramètres biochimiques de la λ-carraghénase, il a été nécessaire de trouver un substrat d’étude possédant une structure proche d’une structure lambda idéale (G2S-D2S,6S). Une analyse RMN de quatre substrats λ-carraghénanes, extraits de Gigartinaceae (G. skottsbergii, G. acicularis, G. pistillata et C. crispus), n’a pas permis de caractériser leur structure, les spectres obtenus étant peu résolus, en raison d’une grande viscosité des solutions. La dépolymérisation du λ-carraghénane de G. skottsbergii par broyage a néanmoins permis d’obtenir un spectre Jmod de résolution correcte (Figure 25). Ce spectre présente les 12 pics carbones caractéristiques d’une structure λ-carraghénane (van de Velde et al., 2004).
Afin d’obtenir des informations structurales plus précises, l’action de la λ-carraghénase a été testée sur ces quatre substrats et l’analyse des produits d’hydrolyse a été effectuée par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et par chromatographie échangeuse d’anions (HPAEC) (Figure 26 A et B). Des profils chromatographiques différents ont été obtenus pour chaque espèce d’algues, caractérisés par un nombre plus ou moins important de produits d’hydrolyse. La complexité de ces profils d’hydrolyse est le reflet de la structure du polymère.
Le λ-carraghénane extrait de G. skottsbergii semblerait posséder la structure la plus régulière. En effet, il a été majoritairement hydrolysé en deux oligosaccharides de petites tailles, alors que les trois autres carraghénanes présentent une fraction résistante importante à l’hydrolyse (Figure 26A).
Les deux oligo-λ-carraghénanes du profil HPAEC du λ-carraghénane extrait de G. skottsbergii (Figure 26B) semblent également présents sur les trois autres profils, au milieu d’autres oligosaccharides de structures non déterminées. La proportion et le nombre de ces derniers sont révélateurs du degré d’irrégularité structurale de ces trois λ-carraghénanes. Les profils chromatographiques des λ-carraghénanes de G. pistillata et G. acicularis sont complexes mais présentent des similitudes très nettes (mêmes pics d’intensités proches). Le profil du λ-carraghénane de C. crispus révèle lui aussi une diversité importante de produits d’hydrolyse mais qui semblent différents de ceux des algues du genre Gigartina.
Le λ-carraghénane de G. skottsbergii a donc été choisi comme substrat d’étude car il semble être le seul de ces 4 substrats à présenter une structure lambda majoritaire, comme le confirmera la caractérisation de ses deux produits d’hydrolyse majoritaires.

Propriétés de la λ-carraghénase.

Mesure de l’activité enzymatique.

L’activité enzymatique des glycoside hydrolases est généralement mesurée par dosage colorimétrique des extrémités réductrices formées au cours de l’hydrolyse par la coupure des liaisons. L’activité des κ- et ι-carraghénases a été précédemment mesurée par réaction d’oxydo-réduction entre les extrémités réductrices G4Sr des κ- et ι-carraghénanes et le ferricyanide (potassium hexacyanoferrate(III)) (Potin et al., 1995). L’activité enzymatique de la λ-carraghénase a été jusqu’à maintenant mesurée principalement par viscosimétrie, le ferricyanide ayant montré une faible activité oxydante envers les extrémités réductrices G2Sr du λ-carraghénane (Greer, 1984). Afin de pallier la faible réactivité des sucres réducteurs du λ-carraghénane, la concentration de ceux-ci dans le milieu a été augmentée d’un facteur 9 avec une faible variation de la concentration en ferrycianide (facteur 1,1). Dans ces conditions, la réactivité des extrémités réductrices des oligo-λ-carraghénanes est mesurable
(Figure 27). La droite étalon ∆DO = f[oligo-λ-carraghénane DP4] a pu être établie. Ces mesures ont confirmé que les extrémités réductrices des oligo-λ-carraghénanes étaient 10 fois moins réactives que celles du D-glucose et de l’oligo-ι-carraghénane DP4 (Figure 27). Le degré de polymérisation (DP) des oligo-λ-carraghénanes DP4 (tétrasaccharide) ou DP6 (hexasaccharide) ne semble pas avoir d’influence sur la réactivité des extrémités réductrices. Leur faible réactivité peut être due à la présence sur l’extrémité réductrice du λ-carraghénane G2Sr d’un groupement sulfate en C2 qui peut gêner la réaction du ferricyanide sur l’hydroxyle réactif en C1 (Greer, 1984).
L’hydrolyse a été réalisée sur des solutions de concentration 0,5%, 0,3% et 0,1% en λ-carraghénane (Figure 28). La concentration en extrémités réductrices a augmenté très rapidement au début de l’hydrolyse, traduisant un grand nombre de coupures, pour ensuite atteindre un plateau lorsque tout le substrat a été hydrolysé vers 300 min d’hydrolyse pour la concentration de 0,5%.
Le calcul des paramètres cinétiques (Km et Vmax) a été tenté mais la faible gamme de concentrations de λ-carraghénane a empêché l’obtention de données exploitables. En effet, en dessous d’une concentration de 0,1% la formation des extrémités réductrices était difficilement détectable et au dessus de 0,5% la viscosité de la solution était trop importante, notamment dans les temps courts (env. 10 min) de l’hydrolyse. L’activité spécifique de la λ-carraghénase a néanmoins pu être estimée à 30 U/mg à une concentration de λ-carraghénane de 0,5%.

Evolution du poids moléculaire du λ-carraghénane au cours de l’hydrolyse.

Afin d’étudier l’évolution du poids moléculaire moyen des chaînes de λ-carraghénane au cours de l’hydrolyse, des prélèvements ont été analysés par chromatographie d’exclusion de taille sur Superdex 200 couplée à une détection MALLS (Figure 29). La détection par réfractométrie de l’élution des chaînes (Figure 29A) a montré, après 15 min d’hydrolyse, une diminution de la taille moyenne des chaînes, précédant leur hydrolyse quasi-totale en oligosaccharides après 3 h d’hydrolyse. Dans les 15 premières minutes, l’hydrolyse des chaînes de λ-carraghénane n’est pas visualisable sur colonne S200, car les chaînes possèdent toujours un poids moléculaire trop élevé et sont exclues de la colonne. Mais l’analyse MALLS de ces chaînes dans ces 15 premières minutes d’hydrolyse (9% des coupures hydrolytiques effectuées) (Figure 29B) a permis de montrer une chute très rapide de 1 430 kDa à 88 kDa, de leur poids moléculaire moyen (Mn). Les chaînes de λ-carraghénanes de 88 kDa obtenues sont d’ailleurs très polydisperses avec un cœfficient de polydispersité (Mw/Mn) de 3,7, alors que le polymère de départ était monodisperse (1,1).
Le tracé de 1/Mnt en fonction du temps d’hydrolyse (t) est une droite (Figure 29C), ce qui est caractéristique d’une dépolymérisation du 1er ordre suivant l’équation : 1/Mnt = 1/Mn0 + kt (Simha, 1941; Masson, 1955). Ces résultats sont caractéristiques d’une dépolymérisation, acide ou enzymatique, par coupures aléatoires dans les chaînes de carraghénanes (Masson, 1955; Singh et al., 1994). Ces coupures conduisent à une dépolymérisation rapide et à une augmentation de la polydispersité.

Formation des produits limites de l’hydrolyse

L’étude de la formation des oligosaccharides a nécessité l’utilisation d’une colonne Superdex 30 de résolution plus fine que la Superdex 200, qui permet de séparer les oligosaccharides de différents degrés de polymérisation (DP) (Figure 30). Les oligo-λ-carraghénanes formés (caractérisés par RMN §III.D) sont peu nombreux et de tailles inférieures à DP8 (octasaccharide). Les oligosaccharides DP4, DP6 majoritaires, et DP8 minoritaire, apparaissent dès le début de l’hydrolyse, et leur concentration augmente au cours de celle-ci. Après 5 h d’hydrolyse, la concentration en DP8 et DP6 décroît, et celle du DP4 augmente. Après un nouvel ajout d’enzyme à 22 h d’hydrolyse, une diminution plus notable du DP6 est observée, conjointement à l’augmentation du DP4 et à l’apparition du DP2.
Etonnamment, les oligosaccharides de tailles intermédiaires (DP10-DP20) n’ont pas été observés par détection réfractométrique. Ceux-ci sont bien présents, mais en quantité très faible, comme le montre l’analyse de ces prélèvements cinétiques par la technique électrophorétique Carbohydrate-PAGE présentée Figure 31. La détection au bleu d’Alcian utilisée avec cette méthode est en effet très sensible à la présence d’oligo-carraghénanes.
Figure 30 : Séparation par chromatographie d’exclusion de taille sur Superdex 30 des oligo-λ-carraghénanes produits lors de l’hydrolyse du λ-carraghénane de G. skottsbergii.
Le DP2 est défini comme un disaccharide.
Figure 33 : Chromatogramme LC-ESI-MS du DP4+S par appariement d’ions sur colonne C18 et spectre de masse obtenu pour ce pic.
Figure 34 : Analyse par LC-MS des produits obtenus après 5 h et 48 h d’hydrolyse, par la technique d’appariement d’ions sur colonne Altima C18.

Purification et caractérisation des produits d’hydrolyse.

Purification des oligo-λ-carraghénanes.

Les oligosaccharides ont été purifiés au stade de l’hydrolyse auquel leur concentration était maximale, c’est-à-dire après 5 h d’hydrolyse pour les oligosaccharides DP8 et DP6, et au stade final de l’hydrolyse (48 h) pour les oligosaccharides DP4 et DP2.
Une première séparation des oligosaccharides, selon leurs degrés de polymérisation, a été réalisée par chromatographie d’exclusion de taille sur la colonne Superdex 30 préparative. L’analyse de chacun des pics de SEC par HPAEC (Figure 32) a révélé la présence de plusieurs oligosaccharides sous un même pic. Par exemple le pic de DP4 de SEC, correspondait en fait à une élution conjointe de deux oligo-λ-carraghénanes DP4 avec des taux de sulfatation différents : DP4 et DP4+S (cf § suivant : caractérisation). Seul le DP2 a été obtenu sous forme pure.
Une seconde purification par HPAEC semi-préparative a permis de séparer les oligosaccharides DP4, DP4+S, DP6 et DP8 des autres oligosaccharides minoritairement présents (indiqués par un astérisque) (Figure 32). Ces derniers étaient présents en trop faible quantité dans l’hydrolysat pour être purifiés et caractérisés par RMN.

Caractérisation des oligo-λ-carraghénanes par spectrométrie de masse.

L’analyse massique par infusion directe des oligo-λ-carraghénanes purifiés DP4, DP4S et DP6 et DP8 n’a pu être réalisée. La densité de charge de trois sulfates par unité disaccharidique est en effet importante et les oligo-λ-carraghénanes se sont fragmentés lors de l’ionisation. Ce phénomène avait déjà été observé pour les oligo-ι-carraghénanes (Antonopoulos, 2005). Seule l’analyse de l’oligo-λ-carraghénane DP2 (D2S,6S-G2S) a été possible, et la masse m/z 193 a été obtenue.
Une analyse des oligosaccharides purifiés DP4, DP4+S, DP6 et DP8 a été néanmoins réalisée indirectement par chromatographie liquide sur colonne C18, couplée à un spectromètre de masse opérant en mode d’ionisation négative (Figure 33). Afin d’être séparés sur la colonne de type C18, les oligo-λ-carraghénanes chargés négativement ont été appariés à des molécules d’heptilamide. Le masquage des charges des oligo-λ-carraghénanes a aussi l’avantage de prévenir la massique de ces pics a montré que pour un même oligosaccharide plusieurs degrés de substitution par les molécules d’heptilamide sont observables, toutes les formes possédant au moins un sulfate libre étant détectées (Tableau 16)
La caractérisation des oligosaccharides minoritaires présents dans les hydrolysats 5 h et 48 h, a aussi pu être réalisée par couplage LC-MS par appariement d’ions sur colonne C18 (Figure 34). La séparation des oligo-λ-carraghénanes obtenue sur colonne hydrophobe C18 est comparable à celle obtenue sur colonne anionique AS11 (Figure 32) bien que les pics soient moins bien résolus, phénomène qui reste pour l’instant à éclaircir. Ces analyses LC-MS ont montré la présence majoritaire des oligo-λ-carraghénanes DP2, DP4, DP6 et DP8. Les produits minoritaires ont pu être identifiés comme étant des oligo-λ-carraghénanes possédant un ou deux sulfates supplémentaires (DP4+S, DP6+S, DP8+S, DP6+2S) ou un sulfate en moins (DP4-S). Seule l’analyse RMN de ces oligosaccharides pourrait déterminer la position de ces sulfates supplémentaires. L’analyse RMN n’a pu être réalisée que pour le DP4+S, purifiable en quantité suffisante.

Table des matières

Introduction générale
I. Les carraghénanes
A. Organisation de la paroi des algues rouges
B. Diversité des algues rouges carraghénophytes.
C. Structure des carraghénanes.
1. Nomenclature des carraghénanes
2. Classification des carraghénanes
D. Origines de la diversité structurale des carraghénanes.
1. Variation de la structure des carraghénanes au cours du cycle de reproduction des algues
2. Localisation des différents carraghénanes dans le thalle
3. Biosynthèse des carraghénanes
E. Propriétés fonctionnelles des carraghénanes
1. Propriétés physico-chimiques
2. Activités biologiques des carraghénanes
II. Analyse structurale des carraghénanes
A. Détermination du poids moléculaire et de la polydispersité.
B. Détermination des unités de répétition des carraghénanes
1. Méthodes chimiques
2. Méthodes spectroscopiques
a. Spectroscopie Infra-Rouge
b. Spectroscopie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire)
3. Analyse par spectrométrie de masse des oligo-carraghénanes
a. Electrospray Ionisation Mass Spectrometry (ESI-MS)
b. MALDI-TOF (Matrice Assisted Laser Desorption/Ionisation / Time Of Flight)
c. Couplage LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)
III. Les carraghénases
A. Généralités
B. La κ-carraghénase
1. De la κ-carraghénase native à la κ-carraghénase recombinante
2. Mécanisme de coupure des κ-carraghénases.
3. Mode d’action des κ-carraghénases
4. Site actif de la κ-carraghénase de P. carrageenovora
C. La ι-carraghénase
1. De la ι-carraghénase native à la ι-carraghénase recombinante
2. Mécanisme de la ι-carraghénase
3. Mode d’action des ι-carraghénases.
4. Site actif de la ι-carraghénase d’A. fortis
Présentation du travail
Chapitre I : Analyse structurale du λ-carraghénane par la λ- carraghénase
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Production et purification de la λ-carraghénase.
II. Choix du substrat d’étude.
III. Propriétés de la λ-carraghénase
A. Mesure de l’activité enzymatique.
B. Evolution du poids moléculaire du λ-carraghénane au cours de l’hydrolyse.
C. Formation des produits limites de l’hydrolyse
D. Purification et caractérisation des produits d’hydrolyse
1. Purification des oligo-λ-carraghénanes
2. Caractérisation des oligo-λ-carraghénanes par spectrométrie de masse
3. Caractérisation des oligo-λ-carraghénanes par RMN.
E. Analyse de la fraction résistante à l’enzyme
F. Etude du mode d’action de l’enzyme
G. Etude du site actif.
DISCUSSION
I. Mode d’action de la λ-carraghénase de P. carrageenovora
II. Spécificité du site actif de la λ-carraghénase.
III. Analyse RMN du λ-carraghénane et des oligo-λ-carraghénanes
IV. Structure hybride du λ-carraghénane de G. skottsbergii
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre II : Analyse structurale des κ/ι-carraghénanes
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Analyse 1H-RMN des κ/ι-carraghénanes
II. Structure hétérogène du κ/ι-carraghénane de G. skottsbergii
III. Caractérisation des oligo-κ/ι-carraghénanes
A. Purification des oligo-κ/ι-carraghénanes par SEC
B. Caractérisation des oligo-κ/ι-carraghénanes par RMN.
C. Détermination de la séquence des motifs dans les oligosaccharides κ−[κ/ι]−κ et κ−[κ/ι/ι]−κ.
IV. Comparaison des profils d’hydrolyse enzymatique de différents κ/ι-carraghénanes.
V. Caractérisation des fractions résistantes aux carraghénases
DISCUSSION
I. Données sur la spécificité du site actif des carraghénases
A. Spécificité de la κ-carraghénase
B. Spécificité de la ι-carraghénase
II. Proposition de schéma d’organisation des κ/ι-carraghénanes
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre III : Analyse structurale des κ/μ-carraghénanes
INTRODUCTION
RESULTATS
I. Analyse 1H-RMN des κ-carraghénanes extraits de K. alvarezii
II. Hydrolyse des κ-carraghénanes transformés et non-transformés par la κ-carraghénase.
III. Caractérisation des oligo-κ/μ-carraghénanes.
A. Purification des oligo-κ/μ−carraghénanes
B. Caractérisation par RMN des oligo-κ/μ-carraghénanes.
C. Caractérisation des oligo-κ/μ-carraghénanes par LC-MS
DISCUSSION
I. Données sur la spécificité du site actif de la κ-carraghénase
II. Les motifs précurseurs mu sont dispersés aléatoirement dans la chaîne de κ-
carraghénane
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Chapitre IV : Conclusions et perspectives
I. Les carraghénases
II. Hydrolyse enzymatique de carraghénanes de structures complexes.
III. Hydrolyse directe sur les algues
Conditions expérimentales
I. Purification des carraghénases
A. Purification de la λ-carraghénase
B. Purification des κ- et ι-carraghénases
II. Sources des carraghénanes étudiés.
III. Conditions des hydrolyses enzymatiques
A. Hydrolyse enzymatique des λ-carraghénanes.
B. Hydrolyse enzymatique des κ-carraghénane et ι-carraghénane
C. Hydrolyse enzymatique des κ/ι-carraghénanes.
D. Hydrolyse enzymatique des κ-carraghénanes extraits de K. alvarezii
E. Hydrolyse enzymatique du carraghénane extrait de I. crispata
F. Hydrolyse enzymatique des algues.
G. Hydrolyse enzymatique des oligo-carraghénanes
IV. Purification des oligo-carraghénanes par chromatographie
A. Purification des oligo-carraghénanes par chromatographie d’exclusion de taille (SEC)
B. Purification des oligo-carraghénanes par chromatographie échangeuse d’anions (HPAEC).
V. Purification des fractions résistantes.
VI. Techniques d’analyse des hydrolysats
A. Dosage colorimétrique des extrémités réductrices formées au cours de l’hydrolyse
B. Analyse des oligo-carraghénanes par électrophorèse
1. Analyse des oligo-λ-carraghénanes par « Carbohydrate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis » (C-PAGE)
2. Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE)
C. Analyse des hydrolysats par chromatographie
1. High Performance Size Exclusion Chromatography – Multi-Angle-Laser-Light- Scattering (HPSEC – MALLS)
2. Chromatographie d’exclusion de taille (SEC)
3. High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC)
D. Analyse par spectrométrie de masse des oligo-carraghénanes
1. Couplage LC-ESI/MS (Liquid Chromatography – Electrospray Ionisation – Mass Spectroscometry)
2. Analyse par infusion directe
E. Analyse RMN
1. Suivi cinétique de l’hydrolyse du λ-carraghénane
2. Analyse 1H-RMN des polysaccharides
3. Analyses RMN 1D (13C, 1H) et 2D des oligosaccharides
Références bibliographiques
Liste des figures
Liste des tableaux
Publications