OMM-CLIC
L’angiogenèse tumorale
Chez l’adulte, la plupart des cellules endothéliales sont quiescentes : seulement une cellule sur 10 000 est dans un cycle de division (Hanahan et Folkman, 1996). L’angiogenèse est alors restreinte à quelques situations physiologiques particulières telles que la cicatrisation, le cycle ovarien chez la femme ou la placentation au cours de la grossesse (Ferrara, 2004).
Cependant, les cellules endothéliales conservent une importante capacité proliférative en réponse à des stimuli physiologiques tels que l’hypoxie pour les vaisseaux sanguins ou l’inflammation pour les vaisseaux lymphatiques. La croissance et la régression du réseau vasculaire sont extrêmement régulées et un dysfonctionnement dans le contrôle de la quiescence des capillaires sanguins contribue au développement, ou aggrave, de nombreuses maladies (psoriasis, arthrite, cécité, ischémie, ostéoporose, obésité, cancer) (Carmeliet, 2003). Parmi les maladies associées à une modification du réseau vasculaire, le cancer est une de celles dont la prévalence est des plus importantes. Une tumeur solide ne peut croître au delà de quelques mm3 sans pourvoir à son approvisionnement en oxygène et nutriments. Elle est alors capable de sécréter des facteurs pro angiogènes qui induisent sa propre vascularisation et permettent ainsi son développement et sa dissémination (Folkman, 1971; Folkman et Hanahan, 1991; Holash et coll., 1999). En effet, une corrélation a été observée entre la densité des micro-vaisseaux tumoraux, les métastases ganglionnaires et la survie des patients. Cette corrélation a été établie pour différents types de tumeurs, notamment les tumeurs du sein (Weidneret coll., 1991; Horaket coll., 1992), du poumon (Macchiariniet coll., 1992), de la prostate (Wakuiet coll., 1992) et du côlon (Bigleret coll., 1993). Il avait ainsi été proposé que le nombre de vaisseaux présents sur une coupe tumorale pourrait être un facteur pronostique pour les patients atteints d’un cancer. Néanmoins, la vascularisation tumorale est anormale. Elle résulte d’un processus angiogénique moins finement régulé que le processusphysiologique, pouvant aboutir à un réseau disproportionné, mimétique et peu fonctionnel (Carmeliet et Jain, 2000; Augusteet coll., 2005; Jain, 2005).
Structure des vaisseaux tumoraux
Diverses molécules sont impliquées dans le processus d’angiogenèse tumorale (pour revue : (Carmeliet et Jain, 2000; Yancopouloset coll., 2000)). Parmi celles-ci, le VEGF et la famille des angiopoïétines ont un rôle prépondérant, et les anomalies associées aux vaisseaux tumoraux pourraient provenir d’un déséquilibre entre ces facteurs régulateurs de l’angiogenèse. La vascularisation tumorale est un processus qui peut se rapprocher de l’angiogenèse physiologique, avec néanmoins quelques particularités (schéma 9). Les vaisseaux tumoraux sont, pour la plupart, issus du réseau vasculaire pré-existant et peuvent être induits par bourgeonnement ou par intussusception (Carmeliet et Jain, 2000). Un mécanisme de vasculogenèse post-natale, par incorporation de précurseurs endothéliaux circulants dérivés de la moelle osseuse, a également été décrit (Asaharaet coll., 1999). Par ailleurs, des cellules tumorales peuvent se développer autour d’un vaisseau préexistant, formant ainsi une sorte de manchon autour du vaisseau. Un processus de mimétisme vasculaire a également été évoqué. Il est illustré par la capacité des cellules de mélanomes agressifs à exprimer un phénotype de cellules endothéliales et à former un réseau de pseudo-vaisseaux dépourvus de cellules endothéliales où les cellules tumorales sont en contact direct avec le sang (Maniotis et coll., 1999). Des analyses transcriptomiques globales,comparant des lignées très agressives et peu agressives de cellules de mélanomes humains de la peau ou de l’uvée, ont montré de manière surprenante que les cellules agressives étaient capables d’exprimer des gènes associés à de multiples phénotypes cellulaires. Notamment, elles peuvent exprimer des marqueurs de cellules endothéliales, épithéliales, de péricytes ou encore de fibroblastes. Elles pourraient également exprimer des gènes associés aux phénotypes des cellules souches précurseurs de ces différents types cellulaires (Seftor EAet coll., 2002; Seftor REet coll., 2002; Hendrix et coll., 2003a). Ce mécanisme de mimétisme vasculaire a été confirmé dans divers carcinomes comme ceux du sein, de la prostate, des ovaires, du chorion ou des poumons, ainsi que dans le phéochromocytome et plusieurs sarcomes (Hendrixet coll., 2003b).
Le VEGF-A
Rôle du VEGF
Les différents types de VEGF et leurs récepteurs
Parmi les facteurs pro-angiogènes, une attention particulière a été portée sur la famille des facteurs de croissance VEGF et de leurs récepteurs à activité tyrosine kinase (Ferrara, 2002; Hicklin et Ellis, 2005). Cette famille de moléculesstructuralement apparentées, inclut chez l’homme les VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D et le PlGF (placental growth factor). Le médiateur clef de l’angiogenèse est le VEGF-A. Il est généralement appelé VEGF. Il s’agit du membre de la famille le plus documenté et a été caractérisé en 1989 par deux équipes simultanément (Ferrara et Henzel, 1989; Plouetet coll., 1989). Il se lie préférentiellement à deux récepteurs, le VEGFR-1 (VEGF receptor 1) et le VEGFR-2 (VEGF receptor 2). En revanche, le VEGF ne montre pas d’affinité pour le VEGFR-3 (VEGF receptor 3) (Shibuya et Claesson-Welsh, 2006). Il peut par ailleurs, activer directement les neuropilines 1 et 2 (Nrp1 et Nrp2) qui agissent comme des co-récepteurs (schéma 12).
Le PlGF ou placental growth factor, dénommé ainsi car il a été cloné dans une banque d’ADNc de placenta humain (Maglioneet coll., 1991), existe sous deux isoformes : le PlGF-1 et le PlGF-2. Il peut former des hétérodimères avec le VEGF, qui ne sont pas nécessairement fonctionnels (Eriksson et coll., 2002). Contrairement au VEGF, il n’est capable de se lier qu’au VEGFR-1 et aux neuropilines (Park et coll., 1994). Des études d’invalidation du gène PlGF n’ont montré aucune anomalie du développement vasculaire chez l’embryon. Cependant, le PlGF semblerait impliqué dans l’angiogenèse pathologique et l’angiogenèse tumorale. Celui-ci augmenterait l’angiogenèse induite par le VEGF, en déplaçant le VEGF du VEGFR-1 et favorisant sa liaison au VEGFR-2 (Carmeliet, 2003). Plus récemment, une approche thérapeutique visant le PlGF au moyen d’un anticorps a été testée chez la souris et a montré des résultats intéressants dans l’inhibition de la croissance tumorale (Fischer Cet coll., 2007).
Le VEGF-B, comme le PlGF, ne se lierait pas au VEGFR-2. La délétion de son gène chez la souris n’induit pas de défaut de développement au cours de l’embryogenèse. Néanmoins, ces souris présentent après la naissance un cœur plus petit, un dysfonctionnement de la vascularisation coronarienne ainsi qu’une incapacité à se rétablir après un accident ischémique cardiaque (Bellomoet coll., 2000). Par ailleurs, le VEGF-B pourrait être impliqué dans la vasculogenèse post-natale (Mouldet coll., 2005).
Le VEGF-A
Le VEGF est un facteur de croissance dont l’expression est très finement régulée. En effet, la délétion d’un seul allèle de son gène est létale(Carmelietet coll., 1996; Ferraraet coll., 1996), ce qui indique une sensibilité importante del’organisme au taux de VEGF, du moins au cours du développement embryonnaire (Dibbens et coll., 2001). De même, la surexpression de 2 à 3 fois du VEGF par rapport à son expression endogène entraîne de graves anomalies du développement cardiaque et une létalité embryonnaire (Miquerol et coll., 2000). Le VEGF est exprimé sous différentes isoformes, plus ou moins actives, qui ont été décrites comme pro-angiogènes pour certaines (les isoformes xxx) et anti-angiogènes pour d’autres (les isoformes xxxb), ce qui permet un niveau supplémentaire de régulation de son effet (Houck et coll., 1992), selon les niveaux d’expression de chacune de ces deux « sous-familles ».
Les isoformes xxx du VEGF-A
Le VEGF existe sous différentes isoformes qui résultent d’un épissage alternatif des 8 exons de son gène (schéma 13). Toutes les isoformes comportent les exons 1 à 5, ainsi que le dernier exon, l’exon 8. Les exons 6 et 7 codent pour un site de liaison à l‘héparine et peuvent être ainsi inclus ou exclus de la protéine. Ces différentes isoformes sont nommées en fonction du nombre d’acides aminés qu’elles comportent et sont ainsi appelées chez l’homme VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189et VEGF206. Les trois formes majoritaires, sont les isoformes 121, 165 et 189, alors que la forme la plus rare est l’isoforme 206 qui n’aurait été décrite que dans une banque d’ADNc de foies fœtaux (Houck et coll., 1991).
L’isoforme 145 a été décrite plus tardivement dans l’utérus humain, et est également assez rare (Charnock-Joneset coll., 1993).
Le VEGF121 est une protéine faiblement acide et ne comporte pas de site de liaison à l’héparine. Le VEGF165 est, à l’inverse, une glycoprotéine basique capable de se lier à l’héparine (Ferrara et Davis-Smyth, 1997). Alors que le VEGF121est une protéine soluble, le VEGF165 est majoritairement associé à la surface cellulaire ainsi qu’à la matrice extracellulaire, bien qu’une fraction soit également sécrétée. En revanche, les VEGF189 et 206 sont presque exclusivement séquestrés dans la matrice extracellulaire (Park et coll., 1993). Le site de liaison à l’héparine serait à l’origine des interactions avec les protéoglycanes de la surface cellulaire. L’affinité de liaison à l’héparine augmente avec la longueur des isoformes. Par ailleurs, les isoformes associées à la matrice extracellulaire peuvent être libérées sous forme soluble et bioactive par de l’héparine ou de la plasmine, par digestion de la partie C-terminale. La partie biologiquement active du VEGF est localisée dans les 110 acides aminés N-terminaux de la protéine (Keytet coll., 1996), ce qui suggère que le VEGF pourrait être accessible à ses cellules cibles par deux mécanismes : la sécrétion de protéines librement diffusibles (VEGF121, VEGF165), et la libération des isoformes plus longues de la matrice extracellulaire (VEGF165, VEGF189, VEGF206) (Ferrara et Davis-Smyth, 1997). Néanmoins, la forme 121 est moins active que la forme 165 (Keytet coll., 1996) et il semblerait que les isoformes plus longues, même liées à la matrice extracellulaire, soient capables d’activer la prolifération de cellules endothéliales (Park et coll., 1993). Ceci suggère que les différentes isoformesdu VEGF, par leur hétérogénéité de structure et de fonction, permettent une réponse biologique graduelle et contrôlée (Ferrara et Davis-Smyth, 1997).
Les récepteurs du VEGF
En plus de la régulation des effets du VEGF par l’existence de ses différentes isoformes xxx et xxxb, les récepteurs du VEGF sont également régulés. Ils existent sous deux formes : soluble et membranaire, qui permettent ou non la transduction du signal, ce qui constitue un niveau de régulation supplémentaire de l’action duVEGF. Le VEGF agit principalement via deux récepteurs : le VEGFR-1 également appelé Flt-1 (Fms-like tyrosine kinase-1) chez la souris et le VEGFR-2 également appelé KDR (kinaseinsert domain-containing receptor) chez l’homme et Flk-1 (fetal liver kinase) chez la souris.
Les VEGFR-1 et VEGFR-2 semblent être tous les deux indispensables au développement d’un réseau vasculaire normal de l’embryon. Les souris invalidées pour l’un ou l’autre gène, meurent in utero entre J8,5 et J9,5, mais montrent des phénotypes différents indiquant que leurs rôles sont distincts (Fonget coll., 1995; Shalabyet coll., 1995). L’invalidation du gène du VEGFR-1 entraîne une incapacité des cellules endothéliales à s’organiser en canal vasculaire normal, celle du gène du VEGFR-2 induit un défaut de vasculogenèse et dedéveloppement des cellules hématopoïétiques.
Effets paracrines
Effets sur les cellules endothéliales
Le VEGF a tout d’abord été décrit comme un facteur de perméabilité vasculaire et a été intitulé pour cela VPF ou vascular permeability factor (Sengeret coll., 1986; Connollyet coll., 1989). L’administration locale de VEGF entraîne une fenestration de l’endothélium des capillaires, également dans les régions où les capillaires ne sont pas normalement fenêtrés, et est associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire (Roberts et Palade, 1995). Par ailleurs, le VEGF est un agent mitogène des cellules endothéliales des micro- et des macro-vaisseaux sanguins ou lymphatiques, mais n’induit pas ou très peu cet effet avec d’autres types cellulaires (Connolly et coll., 1989; Ferrara et Henzel, 1989; Keck et coll., 1989; Leunget coll., 1989; Plouetet coll., 1989; Connet coll., 1990; Pepperet coll., 1994). Dans un modèle d’angiogenèse en gel de collagène, l’addition de VEGF induit une angiogenèse, et les cellules endothéliales confluentes envahissent le gel et forment des structures pseudo-capillaires (Pepperet coll., 1992). Le rôle du VEGF dans l’angiogenèse physiologique est primordial. L’application de polymère diffusant du VEGF dans la zone avasculaire de la cornée de lapin suffit à induire la formation de vaisseaux sanguins (Phillips GDet coll., 1994). Dans ce test, la neutralisation de la signalisation du VEGF par un peptide synthétique bloquant l’interaction entre le VEGF etses récepteurs inhibe la néo-angiogenèse induite par le VEGF (Binetruy-Tournaire et coll., 2000). Par ailleurs, l’induction de l’expression du VEGF augmente la densité de vascularisation dans l’ischémie du membre inférieur (Isner et coll., 1996) et empêche la régression de la vascularisation rétinienne induite par une hyperoxie dans la rétinophatie du prématuré (Alonet coll., 1995).
Au-delà de l’induction d’une néo-vascularisation par angiogenèse, les différentes propriétés du VEGF engendrent une interaction entre les cellules des différents organes qui le produisent et les cellules endothéliales qui expriment ses récepteurs. Notamment, les cellules endothéliales maintiendraient un lien étroit avec les organes de même origine embryonnaire (Coultaset coll., 2005). Dans le foie, les cellules endothéliales activées par le VEGF favorisent la survie et la prolifération des hépatocytes. En réponse au VEGF, les cellules endothéliales du sinus hépatique sécrètent, de manière dépendante du récepteur VEGFR-1, différents facteurs mitogènes, le facteur de croissance hépatique (HGF) et l’IL6, induisant ainsi une croissance hépatique et protégeant les hépatocytes contre des attaques toxiques in vivo (LeCouteret coll., 2003). Dans le pancréas, les cellules endocrines des îlots (telles que les cellules de Langerhans produisant l’insuline) s’associent étroitement avec les cellules endothéliales, sécrétant leurs hormones directement dans le sang. Il semblerait qu’un échange entre les cellules endothéliales et les cellules endocrines s’effectue pour établir un pancréas fonctionnel, notamment via le VEGF et la fenestration des capillaires l’irriguant (Lammertet coll., 2003). Dans le rein, une régulation fine du taux de VEGF est cruciale pour l’établissement et le maintien de la barrière de filtration glomérulaire. La délétion hétérozygote du VEGF dans les podocytes entraîne une maladie rénale caractérisée par une protéinurie et une endothéliose (décrite habituellement dans la prééclampsie), associée à la disparition de la fenestration des capillaires (Eremina et coll., 2003). De même, pour la glande surrénale, l’expression du VEGF est induite par l’ACTH dans les cellules fasciculées bovines et humaines in vitro (Gaillardet coll., 2000; Heikkilaet coll., 2000). L’administration de dexaméthasone chez la souris inhibe la sécrétion d’ACTH et induit une forte diminution de l’expression du VEGF ainsi que l’altération de l’architecture vasculaire conjointement à la régression du tissu endocrine (Keramidaset coll., 2004). Par ailleurs, le VEGF est capable d’induire in vitro et de manière dose-dépendante une vasodilatation, et de produire ainsi une hypotension associée à une tachycardie transitoire (Ku et coll., 1993). Cet effet serait provoqué par de l’oxyde nitrique issu des cellules endothéliales.
Table des matières
Liste des schémas et des figures
Liste des abréviations
INTRODUCTION
1. L’Angiogenèse
1.1. Le réseau vasculaire
1.1.1. Structure des vaisseaux sanguins
1.1.2. La vasculogenèse
1.1.3. L’angiogenèse
1.1.4. La lymphangiogenèse
1.2. L’angiogenèse tumorale
1.2.1. Structure des vaisseaux tumoraux
1.2.2. Switch angiogénique
1.2.3. Tumeur et environnement tumoral
Conclusion
2. Le VEGF-A
2.1. Rôle du VEGF
2.1.1. Les différents types de VEGF et leurs récepteurs
2.1.2. Le VEGF-A
2.1.2.1. Les isoformes xxx du VEGF-A
2.1.2.2. Les isoformes xxxb
2.1.3. Les récepteurs du VEGF
2.1.4. Les effets du VEGF
2.1.4.1. Effets paracrines
2.1.4.1.1. Effets sur les cellules endothéliales
2.1.4.1.2. Effets sur les autres types cellulaires
2.1.4.2. Effets autocrines
2.1.5. VEGF et angiogenèse tumorale
2.2. Régulation de l’expression du VEGF
2.2.1. Régulation de la transcription
2.2.2. Régulations post-transcriptionnelles
2.2.2.1. Régulation de la stabilité de l’ARNm
2.2.2.1.1. Les protéines stabilisatrices et déstabilisatrices
2.2.2.1.2. Les séquences ARE et la région 3’-UTR de l’ARNm du VEGF
2.2.2.2. Régulation de la traduction
2.3. Thérapies anti-angiogènes et VEGF
2.3.1. Les différentes thérapies ciblant le VEGF et leurs effets secondaires
2.3.2. Les résistances aux traitements anti-angiogènes
Conclusion
3. Les protéines de la famille TIS11 et la protéine TIS11b
3.1. Les protéines de la famille TIS11
3.1.1. TTP
3.1.2. TIS11b
3.1.3. TIS11d
3.2. Expression des protéines TIS11
3.2.1. Expression physiologique
3.2.2. Expression dans des tumeurs ou lignées tumorales
3.3. Mécanismes de déstabilisation des ARNm
3.3.1. Les éléments ARE
3.3.2. Mécanismes moléculaires de déstabilisation et de dégradation des ARNm
3.4. Domaines actifs et troncations des protéines TIS11
3.5. Régulation de l’activité déstabilisatrice des protéines TIS11
3.5.1. Autorégulation de l’expression de l’ARNm des protéines TIS11
3.5.2. Régulation par phosphorylation
Conclusion
4. Les PTD
4.1. Origine et principe
4.2. Mécanismes de l’internalisation
4.3. Vectorisation de molécule et toxicité
Conclusion
RESULTATS
1ère Partie : Adressage intracellulaire de TIS11b et déstabilisation de l’ARNm du VEGF
1. Introduction
2. Article : “Protein Transduction Domain-mediated intracellulardelivery of the TTP family member TIS11b/BRF1 downregulates VEGF expression invitro and in vivo”
3. Résumé des résultats et discussion
3.1. Construction des protéines de fusion Flag-PTD-TIS11b et évaluation de leur activité déstabilisatrice
3.2. Activité déstabilisatrice de TIS11b et des protéines de fusion Flag-PTD-TIS11b sur l’ARNm du VEGF endogène
3.3. Production et purification des protéines de fusion Flag-PTD-TIS11b
3.4. Internalisation des protéines de fusion Flag-TIS11bet Flag-PTD-TIS11b
3.5. Activité des protéines de fusion Flag-PTD-TIS11b purifiées sur la stabilité de l’ARNm du VEGF et la production de la protéine VEGF
3.6. Effet des protéines de fusion Flag-R7- ou Flag-R9-TIS11b sur l’expression du VEGF dans la glande corticosurrénalienne
Conclusion
2ème Partie : Effet de TIS11b sur la croissance tumorale
1. Introduction
2. Résultats et discussion
2.1. Effet de TIS11b sur la stabilité de l’ARNm du VEGF dans les cellules LL2
2.2. Prolifération des cellules LL2 et LL2-TIS11b in vitro
2.3. Croissance tumorale des cellules LL2 et LL2-TIS11b chez la souris nude
Conclusion
2.4. Effet de l’injection de protéines Flag-PTD-TIS11b sur la croissance tumorale de tumeurs pré-établies
Conclusion
3. Matériel et méthodes
3.1. Co-transfection et mesure de l’activité « Dual Luciferase »
3.2. Construction des plasmides rétroviraux
3.3. Transfection des plasmides rétroviraux dans les cellules LL2
3.4. Tests de prolifération des cellules
3.5. Transplantation des cellules par voie sous-cutanée
3.6. Injection des protéines Flag-R7- ou Flag-R9-TIS11b dans les tumeurs pré-établies
3.7. Purification des ARNm et Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR) semi quantitative
3 ème Partie : Phosphorylation de TIS11b par la protéinekinase A (PKA)
1. Introduction
2. Résultats et discussion
2.1. Phosphorylation de TIS11b dans les cellules BAC en culture en réponse à l’ACTH
2.2. Phosphorylation de TIS11b par la PKA in vitro
2.3. Identification des sites potentiels de phosphorylation par la PKA in silico
2.4. Phosphorylation in vitro des protéines TIS11b mutées TIS11b-54A et TIS11b-334A par la PKA
2.5. Détermination du site de phosphorylation par la réalisation d’une carte peptidique
2.6. Effet des protéines TIS11b tronquées sur la stabilité de l’ARNm du VEGF
2.6.1. Construction des protéines TIS11b tronquées
2.6.2. Effet des protéines TIS11b tronquées sur la stabilité de l’ARNm du VEGF
2.7. Effet des protéines mutées TIS11b-54A et TIS11b-334A sur la stabilité de l’ARNm du VEGF dans les cellules COS7 en culture
2.8. Effet des protéines mutées TIS11b-54A et TIS11b-334A sur la stabilité de l’ARNm du VEGF dans les cellules BAC en culture
Conclusion
3. Matériel et méthodes
3.1. Phosphorylation de TIS11b dans les cellules BAC en culture en réponse à l’ACTH
3.2. Phosphorylation de TIS11b par la PKA in vitro à partir d’extrait bactérien
3.3. Phosphorylation des peptides par la PKA in vitro
3.4. Construction des plasmides
3.5. Synthèse et purification des protéines TIS11b sauvage ou mutées
3.6. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
3.7. Co-transfection et mesure de l’activité « Dual Luciferase »
3.8. Purification des ARNm et Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR) semi quantitative
3.9. Western blot
4 ème Partie : Effet de la protéine tronquée TIS11b-ZnC,fusionnée à l’Opicalcine, sur l’ARNm du VEGF
1. Introduction
2. Résultats et discussion
2.1. Construction de la protéine de fusion TIS11b-ZnC-OCaQ
2.2. Effet de TIS11b-ZnC-OCaQ sur la stabilité de l’ARNmLuc-3’UTR du VEGF
2.3. Effet de TIS11b-ZnC-OCaQ purifiée sur l’ARNm du VEGF endogène
2.4. Effet de TIS11b-ZnC-OCaQ purifiée sur l’expression de la protéine VEGF endogène
2.5. Effet de TIS11b-ZnC-OCaQ sur l’expression du VEGF dans la glande corticosurrénalienne de souris
Conclusion
3. Matériel et méthodes
3.1. Mutation de l’OCa en OCaQ
3.2. Construction de TIS11b-ZnC-OCaQ
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES
BIBLIOGRAPHIE
