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Diagnostic au laboratoire biologique de la syphilis

Indications du diagnostic :

 D’après les recommandations de la Haute Autorité de Santé, le dépistage doit avoir lieu dans les situations suivantes [34] :
• Les travailleurs du sexe ayant des rapports non protégés.
• Les personnes fréquentant les travailleurs du sexe et ayant des rapports non protégés.
• Lors du diagnostic ou en cas d’antécédent d’IST à type de gonococcie, de
• lymphogranulomatose vénérienne ou d’infection à VIH.
Les personnes ayant des rapports non protégés avec plusieurs partenaires par an.
• Les migrants en provenance de zone d’endémie (Afrique, Asie, Europe de l’Est,
• Lors d’une incarcération.
• Après un viol.
• Chez les femmes enceintes, le dépistage est obligatoire en France lors du premier examen prénatal. Il sera renouvelé en cas de comportement à risque au plus tard à 28 SA afin de pouvoir prendre en charge la patiente en cas de séroconversion. Il sera réalisé après l’accouchement en absence de notion de dépistage au cours de la grossesse [35].
La nomenclature des actes de biologie médicale impose l’utilisation d’un test tréponémique (TT) couplé à un test non tréponémique (TNT) pour le dépistage de la syphilis [29].

Produits pathologiques

Les prélèvements pour un diagnostic direct doivent être faits de préférence avant toute antibiothérapie [36]. Le germe peut être mis en évidence aussi bien dans les lésions primaires que secondaires.
En cas de suspicion de syphilis primaire, le chancre est prélevé après nettoyage au sérum physiologique. Ce prélèvement s’effectue de préférence au laboratoire, ou à défaut, sera acheminé dans les 30 minutes. Le prélèvement doit ramener une sérosité exempte de sang qui permettra un examen microscopique direct à l’état frais ou après coloration. En cas de suspicion de syphilis secondaire, la recherche se fait à partir de lésions de la peau, des lésions tissulaires, de l’humeur vitrée ou du liquide céphalo-rachidien [37].
Le LCR doit être prélevé dans les cas de suspicion de neurosyphilis. Il permettra de mettre en évidence une pléiocytose, une hyperprotéinorachie, la présence d’anticorps spécifiques ou la présence d’ADN bactérien par PCR. L’ensemble de ces analyses est absent de la nomenclature des actes de biologie médicale (NABM) [29].
Devant une suspicion de syphilis congénitale, la recherche se fait à partir du sang du cordon ombilical, du placenta, des sécrétions nasales ou buccales et de la peau [37].
Pour le diagnostic indirect ; le prélèvement de sérum se fait sur un tube sans anticoagulant (dit « sec »), avec ou sans gel séparateur, pour la recherche d’anticorps. On peut aussi utiliser du plasma (notamment dans les tests tréponémiques automatisés) prélevé sur un tube EDTA. Le patient n’a pas besoin d’être à jeûn au moment du prélèvement. En cas de suspicion d’atteinte neurologique ou ophtalmique, il est nécessaire de faire un recueil de liquide céphalo-rachidien [37]. Dans ce cas, le prélèvement est fait dans un tube stérile de bactériologie.
NB :
Ne pas oublier le ou la partenaire.
Après prélèvement, stériliser tout le matériel de prélèvement.

Méthodes de diagnostic

Diagnostic direct

Microscopie à fond noir

Cet examen consiste à observer une préparation entre lame et lamelle à partir de prélèvements de lésions primaires ou secondaires de la peau ou des muqueuses, à la recherche de bactéries spiralées dont la mobilité est caractéristique (en tire-bouchon). L’observation doit être réalisée dans le quart d’heure qui suit le prélèvement car T. pallidum est très sensible à l’oxygène [37].
Figure 10: Observation de tréponèmes en microscopie à fond noir
Aucune distinction n’est possible entre T. pallidum et les autres tréponèmes saprophytes. Cet examen est donc peu spécifique et à l’origine de nombreux faux positifs notamment si la lésion est située au niveau des muqueuses buccales ou anales [36]. La microscopie à fond noir ne doit donc jamais être réalisée sur des lésions oro-pharyngées [37].
La lecture au microscope est très subjective, le résultat est dépendant de l’expérience du lecteur. La sensibilité est estimée entre 70-80% avec un excellent lecteur en sachant que l’examen à fond noir perd de sa sensibilité dans certaines situations
• prélèvement hémorragique ;
• application d’antiseptiques locaux avant le prélèvement ;
• prise récente d’antibiotiques.
Cet examen est réservé à certains laboratoires expérimentés et à proximité des unités de consultation. Il n’apparaît pas dans la NABM (38).

Coloration

La coloration de Gram est inutilisable pour visualiser les spirochètes car ils ne prennent pas cette coloration. Ils sont faiblement colorables au Giemsa. On peut éventuellement utiliser des colorations argentiques (Fontana-Tribondeau, Warthin-Starry) mais sa réalisation est délicate et non faite en routine [2].

Immunofluorescence directe

Le frottis est recouvert d’une dilution d’anticorps anti-T.pallidum marqués par un fluorochrome ou révélés dans un second temps par une antiglobuline spécifique marquée à la fluorescéine. Les principaux avantages de cette technique sont un gain de sensibilité et de spécificité par rapport à la microscopie sur fond noir ou à la coloration argentique [36]. Elle est cependant aujourd’hui complètement obsolète [37].

Test d’infectivité sur lapin

Cette technique est praticable uniquement dans les laboratoires spécialisés. Il s’agit de la technique directe la plus sensible et c’est la seule permettant de mettre en évidence la présence de tréponèmes virulents (par opposition aux tréponèmes saprophytes). La mise en évidence du tréponème vivant se fait dans le testicule de lapin (orchite) après inoculation de celui-ci. La sensibilité est proche de 100% pour un malade n’ayant pas reçu d’antibiotiques [36].

Amplification génique

Cette technique a remplacé le diagnostic direct au microscope à fond noir. C’est aujourd’hui la seule encore utilisée en pratique courante pour le diagnostic direct de la syphilis. Son prix reste élevé et cette analyse n’est pas inscrite dans la nomenclature des actes de biologie médicale [38]. Elle est donc peu utilisée mais peut s’avérer utile dans trois situations cliniques :
• syphilis primaire : mise en évidence du germe directement dans les chancres atypiques pour lesquels l’évocation clinique n’est pas évidente, ou en cas de syphilis primaire très précoce. Dans ce cas, la PCR sera positive avant les sérologies [37]. La Tp-PCR présente une meilleure sensibilité et spécificité que la microscopie à fond noir pour le diagnostic de la syphilis primaire [39];
• neurosyphilis : mise en évidence du germe dans le LCR. Les résultats sont variables selon la littérature [36] ;
• uvéite syphilitique : mise en évidence du germe dans l’humeur vitrée ;
• syphilis congénitale : mise en évidence dans le liquide amniotique [36].
Les deux principales cibles d’amplification du génome de T. pallidum sont le gène codant la protéine de membrane de 47 kilodaltons (tpp47) et le gène codant pour l’ADN polymérase I (poIA). Ces deux méthodes semblent avoir les mêmes performances [40].

Diagnostic indirect

La sérologie est la technique la plus couramment utilisée pour le diagnostic, le dépistage et le suivi du traitement de la syphilis. Même avec les méthodes les plus sensibles, il existe une période en début d’infection où la sérologie est négative. En cas de suspicion de rapport contaminant récent, il convient donc de systématiquement contrôler la sérologie à trois semaines.

Tests tréponémiques (TT)

 Méthodes manuelles 2.3.2.1.1 TPHA et TPPA
Il s’agit d’une réaction d’agglutination entre des hématies (TPHA) ou des particules de gélatine (TPPA) sensibilisées avec un ultrasonat de T. pallidum (souche Nichols) et les anticorps anti-tréponémiques du patient [36]. Ces deux techniques sont de sensibilité et de spécificité équivalentes [37].
Une réaction de dépistage est d’abord effectuée, le sérum est testé au 1/80e, 1/160e, 1/320e. Si cette réaction de dépistage est positive, on titre en effectuant la même réaction avec des dilutions successives de deux en deux du sérum. Le titre d’anticorps est déterminé comme la dernière dilution donnant une réaction positive.
Ces méthodes sont très spécifiques (>99% pour le TPHA et 95% pour le TPPA) [41,42] et très sensibles, sauf dans les stades très précoces de la maladie. Il se positive dans les dix jours suivant l’apparition du chancre. Le TPHA reste positif très longtemps, même des années après la guérison du patient. Il se négative en cas de traitement précoce [37].
L’inconvénient principal de ces techniques est qu’elles ne sont réalisables que par méthode manuelle : le coût en temps technicien est élevé et la lecture difficile est moins reproductible qu’une technique automatisée car elle dépend de l’expérience du technicien. On décrit de très rares faux positifs dans des maladies auto-immunes, la lèpre, la grossesse, chez des sujets avec des taux élevés d’IgM, A ou G non spécifiques, chez les toxicomanes [37].

FTA (Fluorescent Treponemal Assay)

Cette technique permet une détection anticorps anti-tréponémiques par immunofluorescence indirecte. Des tréponèmes entiers inactivés (souche Nichols) [43] sont fixés sur une lame que l’on met en contact avec le sérum du patient. Après lavage, on révèle les anticorps fixés par une antiglobuline humaine marquée par un fluorochrome, et la lame est lue en épifluorescence [37].
Le résultat est semi-quantitatif, sous forme de titre correspondant à la dernière dilution de sérum rendant une réaction positive. Ce test donnant de nombreux faux positifs, il a été modifié pour donner le FTA-Abs (FTA absorbé) : le sérum est préalablement mis en contact d’un ultrasonat de tréponèmes saprophytes non pathogènes (souche Reiter), afin d’absorber les anticorps non spécifiques de Treponema pallidum. En fonction de l’antiglobuline utilisée, ce test permet de détecter spécifiquement les IgG, les IgM, ou les immunoglobulines totales.
La cinétique du FTA-Abs est superposable à celle du TPHA avant traitement. Il ne se négative aussi qu’en cas de traitement précoce [37]. Les anticorps sont décelables peu après l’apparition du chancre, et à tous les stades de la maladie. Le test est sensible (84 à 100% selon les stades) et spécifique (97%) [41]. Il permet de confirmer un diagnostic et de suivre l’efficacité d’un traitement. Il existe des faux positifs : maladie auto-immunes, autres spirochétoses (borréliose de Lyme, leptospirose), herpès génital [37].
Ce test est devenu obsolète du fait de son important temps de manipulation, son coût élevé et les difficultés de sa lecture [44].

Tests Immunochromatographiques (ICT)

Ce sont des Tests Rapides d’Orientation Diagnostique (TROD). Cette technique ne permet pas de tester de grandes séries d’échantillons. Il s’agit d’une variante des tests ELISA/EIA, en technique manuelle sur sang total [37]. Il en existe actuellement plus d’une vingtaine sur le marché mondial [45]. En France, un rapport de l’ANSM de décembre 2015 en identifie 10 disponibles [46]. Leur utilisation n’est pas recommandée dans les régions où un diagnostic de la syphilis classique est possible [44].
Ce sont des tests qualitatifs par immunochromatographie sur bandelette ou équivalents. Ils sont recouverts d’antigènes spécifiques qui détectent la présence d’anticorps anti-Treponema pallidum. Un test « multiplex » permet de réaliser simultanément le dépistage du VIH.
Il s’agit du SD BIOLINE Duo HIV/Syphilis rapid d’Alere®, il s’inscrit dans le programme de l’OMS de lutte contre la syphilis congénitale par un dépistage associé à celui du VIH chez les femmes enceintes [47].
Ces tests détectent la présence d’anticorps spécifiques de T. pallidum et sont donc équivalents aux méthodes immunoenzymatiques. Tous détectent les IgG. Quatre d’entre eux détectent les IgM et les IgG et quatre les IgG, IgM et IgA.
Ces TROD permettent ainsi le dépistage de la syphilis quel que soit le stade de l’infection, notamment en phase précoce [46].
La sensibilité s’échelonne de 65% à 100% selon les TROD, et la spécificité de 94,7% à 100% [43].
Le résultat est uniquement qualitatif [37]. Une confirmation par un autre test en cas de positivité est nécessaire afin de déterminer le titre des anticorps [36]. Ces tests sont très utiles en screening notamment dans les pays en voie de développement où la formation des techniciens et le matériel disponible (centrifugeuse) sont parfois limités.

PaGIA (Particle Gel ImmunoAssay)

Cette technique utilise des billes fixées avec des antigènes recombinants (TpN15, TpN17 et TpN47) placées dans une matrice en gel équivalente à celles utilisées pour les groupes sanguins. Après centrifugation, on obtient une agglutination si le sérum est positif .
Le résultat est uniquement qualitatif et obtenu en vingt minutes [36]. L’intérêt de cette technique est la rapidité et la simplicité de sa mise en œuvre avec un minimum de matériel requis (pipette et centrifugeuse). Cette technique peut s’avérer très utile pour le screening des donneurs de sang, puisqu’elle utilise le même matériel que pour la détermination des groupes sanguins. Sa mise en œuvre est plus facile que l’ELISA ou le FTA-abs [48]. Elle présente une sensibilité de 89% comparable au TPPA et une meilleure spécificité de 100% (sur 650 échantillons testés dont 48 positifs) [49].

Western Blot (WB) ou test d’immuno-empreinte

Des protéines spécifiques de T. pallidum sont séparées par électrophorèse et transférées sur une membrane de nitrocellulose que l’on met en contact avec le sérum du patient. En fonction de l’antiglobuline utilisée pour la révélation, on pourra rechercher séparément les IgG et les IgM [36].
Il existe plus de 22 antigènes tréponémiques mais trois protéines sont suffisantes et essentielles pour affirmer la spécificité des anticorps détectés [37] :
• la protéine 17kDa : protéine membranaire ;
• la protéine 15kDa : protéine membranaire ;
• la protéine 47kDa : lipoprotéine membranaire majeure
Figure 12: Bandelettes de Western Blot et antigènes de la syphilis
Méthode de confirmation dans les cas douteux. Elle présente un intérêt en cas de suspicion de syphilis congénitale. Dans ce cas, on compare la bandelette du WB IgG obtenu sur le sérum du nouveau-né et celle de la mère, et on associe un WB pour la recherche d’IgM chez le nouveau-né. Un Western blot IgG est considéré indicatif chez un nouveau-né s’il présente au moins une bande absente chez la mère [58].
 Méthodes automatisées
Il existe une très grande variété de tests tréponémiques automatisés disponibles sur le marché.
La plupart de ces tests mettent en jeu une détection immuno-enzymatique. Ils peuvent utiliser le tréponème entier, des antigènes purifiés ou des antigènes recombinants tels que 15TpN, 17TpN, 47TpN [50]. Ils permettent de détecter sélectivement les IgG, les IgM, ou les immunoglobulines totales. D’autres méthodes mettent en jeu une variante du TPHA avec une détection par turbidimétrie :

Enzyme Linked ImmunoAssay (ELISA) :

L’antigène est fixé sur la cupule de réaction.
Le sérum du patient contenant les anticorps à doser est mis en contact des antigènes fixés. La réaction antigène-anticorps du patient est mise en évidence grâce à un conjugué : antiglobuline humaine associée à une enzyme. L’ajout du substrat produit une réaction colorée dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’anticorps présente dans le sérum du patient ;

Chimiluminescence Immunoassay (CLIA) :

Il s’agit d’une variante de l’ELISA, le deuxième anticorps est conjugué à une enzyme qui émet de la lumière lorsqu’elle est en contact d’un substrat de chimiluminescence .

Multiplex Flow Immunoassay (MFI) [51] :

Détection par cytomètrie en flux de microbilles liées à des protéines recombinantes de T. pallidum (15kDa, 17kDa,47kDa).
Cette technique permet de réaliser en simultané différentes immunoanalyses sur un volume qui serait insuffisant avec les techniques classiques [52]. Elle permet d’étudier simultanément les IgG et les IgM et de rechercher d’autres IST (HIV, HSV).
Cette technique a montré d’excellentes performances, avec une sensibilité de 98,7% et une spécificité de 98,5% [53]. Une étude comparant cette technique à la CMIA sur l’automate Architect montre que la cytométrie en flux présente une spécificité bien plus importante [54] ;

Turbidimtrie :

Ces techniques sont basées sur l’agglutination de billes de latex, avec lecture de la réaction par mesure de la turbidimétrie. Ces techniques permettent, contrairement aux autres citées plus haut, d’obtenir un résultat quantitatif. D’après les notices des kits, un échantillon présentant un résultat de 1280 TU (Titer Units) correspondrait approximativement à un titre 1/1280 retrouvé avec la technique TPHA.
Ces tests semblent donner des résultats assez bien corrélés entre eux et avec des titres hauts ou bas en technique FTA-Abs [50]. Les taux évoluent de manière cohérente avec l’évolution clinique, et un taux d’anticorps supérieur à 1000 TU permet de suspecter une infection active par Treponema pallidum.
L’intervalle de linéarité de ces tests est entre 0 et 300 TU, ce qui rend des dilutions nécessaires pour différencier les infections actives des cicatrices sérologiques [55].
A ce jour, peu d’études sont publiées sur ces tests relativement récents.
Les TT automatisés ont une sensibilité au moins aussi bonne que les TNT, tout en étant plus spécifiques [56]. Ils se positivent très précocement au cours de la syphilis (surtout les IgM) mais en cas de positivité, le recours à d’autres tests non tréponémiques (VDRL/RPR) s’avère nécessaire pour confirmer le diagnostic et différencier les cas de figures notamment liés au traitement précoce ou tardif du patient, ou à sa réinfection [37]. Les IgM sont les premiers anticorps à apparaître dès la deuxième semaine de l’infection, suivis rapidement par les IgG [37].
Ces différentes techniques automatisées présentent plusieurs avantages par rapport aux techniques manuelles classiques [51] :
• une meilleure cadence avec des manipulations réduites au minimum ;
• une meilleure sensibilité ;
• une interprétation plus objective des résultats ;
• une absence d’effet de zone.
La plupart de ces tests rendent un résultat final qualitatif (positif ou négatif) qui oblige à réaliser des tests complémentaires semi-quantitatifs (tréponémiques et non tréponémiques) lorsque le résultat est positif, afin d’avoir un taux d’anticorps permettant l’interprétation précise du stade de l’infection et le suivi du traitement. Cela fait d’ailleurs partie des recommandations de la HAS
[34 ;57].

Tests non tréponémiques (TNT)

Réactions à antigène non tréponémique : VDRL et RPR

Ces tests mettent en œuvre une réaction d’agglutination passive des réagines syphilitiques en présence d’un antigène, le cardiolipide, complexé à des particules de charbon (RPR) ou de latex (VDRL) [37]. Cet antigène est présent chez Treponema pallidum et autres tréponèmes, mais aussi dans les tissus de végétaux ou d’animaux (surtout le cœur et le foie) [36].
Cette technique a été utilisée historiquement par Wassermann. Celui-ci a appliqué la réaction de fixation du complément de Bordet pour le premier sérodiagnostic de la syphilis.
Aujourd’hui encore certains prescripteurs appellent encore cette analyse BW pour réaction de Bordet Wassermann [36]. Les tests non tréponémiques mettent en jeu deux étapes :
 Le dépistage : la réaction est qualitative ;
 Le titrage : concerne uniquement les sérums positifs. On quantifie la réaction en l’effectuant successivement sur des dilutions
croissantes du sérum du patient allant de deux en deux. Le titre correspond à la dernière dilution où l’on observe la présence d’agglutinats [37].
Les TNT se positivent 10 à 20 jours après l’apparition du chancre [37]. Les titres sont bien corrélés à l’évolutivité de la maladie. Ce sont de bons marqueurs de suivi de l’efficacité thérapeutique car ils se négativent sous traitement même tardif. Ils sont donc un marqueur de l’efficacité thérapeutique et d’un traitement bien conduit [37]. C’est aujourd’hui la seule technique utilisée et recommandée pour suivre l’efficacité d’un traitement antibiotique.
Les sensibilités en fonction des différents stades de la maladie sont regroupées dans le tableau suivant [41] : Tableau II: Sensibilités des TNT manuels en fonction du stade de la maladie [41]

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 : Généralités sur la syphilis
1-1 Définition
1-2 Classification
1-3 Historique
1-4 Epidémiologie
1-5 Agent pathogène
1-5-1 Vue au microscope ordinaire
1-5-2 Vue au microscope électronique
1-5-3 Caractères bactériologiques et immunologiques
1.5.4 Virulence et pouvoir pathogène
1-6 Physiopathologie
1-7 Signes cliniques
1-7-1 La phase primaire
1-7-2 La phase secondaire
1-7-3 La phase tertiaire
1-7-4 La syphilis congénitale
1-7-5-1 Le PIAN
1-7-5-2 Le BEJEL
1-7-5-3 Le PINTA
1-8 Traitement
1-9 Prévention
Chapitre 2 : Diagnostic au laboratoire biologique de la syphilis
2-1 Indications du diagnostic
2-2 Produits pathologiques
2-3 Méthodes de diagnostic
2-3-1 Diagnostic direct
2.3.1.1. Microscopie à fond noir
2.3.1.2. Coloration
2.3.1.3 Immunofluorescence directe
2.3.1.4 Test d’infectivité sur lapin
2.1.3.5 Amplification génique
2-3-2 Diagnostic indirect
2-3-2-1 Tests tréponémiques
2.3.2.1.1 TPHA et TPPA
2.3.2.1.2 FTA
2.3.2.1.3 Tests Immunochromatographiques
2.3.2.1.4 PaGIA
2.3.2.1.5 Western Blot (WB) ou test d’immuno-empreinte
2.3.2.1.6. Enzyme Linked ImmunoAssay
2.3.2.1.7. Chimiluminescence Immunoassay
2.3.2.1.8. Multiplex Flow Immunoassay
2.3.2.1.9. Turbidimtrie
2.3.2.2.Tests non tréponémiques
2.3.2.2.1 Réactions à antigène non tréponémique : VDRL et RPR
2-4 Interprétation
2-4-1 Syphilis primaire
2-4-2 Syphilis secondaire
2-4-3 Syphilis latente
2-4-4 Syphilis tertiaire et neurosyphilis
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I. Objectifs de l’étude
I.1 Objectif général
I.2 Objectifs spécifiques
II. Type, période et cadre d’étude
III. Matériel et méthodes
III.1 Matériel
III.2 Méthodes
III.2.1 Population d’étude
III.2.2 Analyse au laboratoire
III.2.2.1 TPHA
III.2.3- Saisie et analyse des données
IV. Résultats et Discussion
IV.1. Résultats
IV.1.1 Echantillonnage
IV.1.2 Patients inclus dans l’étude
IV.1.3. Proportion des patients en fonction du sexe
IV.1.4. Proportion des patients selon leur tranches d’âge
IV.1.5. Proportion des patients selon le statut
IV.1.6. Répartition des patients selon le service d’origine
IV.1.7 Répartition selon le motif de diagnostic renseigné
IV.1.8 Prévalence syphilitique
IV.1.9 Prévalence syphilitique selon l’année
IV.1.10 Prévalence syphilitique selon les tranches d’âge
IV.1.11 Prévalence syphilitique selon le sexe
IV.1.12 Prévalence syphilitique en fonction du statut
IV.1.13 Prévalence syphilitique selon les services de provenance
IV.1.14 Prévalence syphilitique et autres sérologies demandées.
IV.1.15. Prévalence syphilitique chez les femmes enceintes.
V. Discussion et commentaires
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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