Admin CliCours
Développement d’un clone du DWV par recombinaison homologue en levure
Les virus de l’abeille, bien que répandus et de plus en plus étudiés en cagette et in situ, ne sont cependant que très peu voire pas du tout étudiés in vitro. Approfondir les connaissances encore parcellaires sur les mécanismes d’infection pourrait permettre d’affiner nos études de co-expositions. Les clones moléculaires de virus peuvent être utilisés comme des outils de génétique inverse pour mieux étudier ces mécanismes, leurs génomes et les protéines qu’ils produisent. Le génome du CBPV a été cloné récemment par Ibrahim Youssef lors de sa thèse au laboratoire de l’Anses Sophia Antipolis, ce qui lui a permis d’étudier plus en détails notamment les ORF présents sur ce génome (Youssef, 2016). De plus, la plupart des infections virales chez l’abeille sont étudiées en utilisant des inocula extraits à partir d’échantillons d’abeilles infectées naturellement. Cependant, compte tenu de la relative proximité génétique et structurale des principaux virus qui infectent l’abeille domestique (DWV, BQCV, le complexe AKI, et SBV par exemple sont tous des virus de l’ordre Picornavirales) il est extrêmement difficile même en passant par une étape de purification d’être sûr de n’inoculer que le virus étudié. Dès lors, le développement d’un outil permettant une production constante de souches spécifiques à chaque variant, multipliées in vitro, peut permettre d’obtenir des inocula purs du virus d’intérêt, de diminuer les biais dûs à des infections multiples, et d’augmenter la répétabilité des expériences. Dans le cas du DWV, un clone infectieux du DWV-A a déjà été développé par Lamp et al., 2016. Nous avons ici utilisé une autre technique avec une ligation par passage en levures d’après Desbiez et al., 2012, et produit des clones infectieux d’une souche locale de DWV-A, ainsi que d’un recombinant DWV-A/B (Dalmon et al., 2017). De plus, nous avons tenté de fabriquer des clones permettant d’être directement inoculé aux nymphes sans passer par une étape de transcription in vitro, ce qui n’est pas le cas des clones cités. Les résultats obtenus lors de ce développement d’un clone et des tests d’infectiosité qui ont suivi sont présentés sous forme d’article en prévision d’une valorisation scientifique. Cependant cet article devra être complété par des expériences ultérieures avant soumission à un journal pour publication. En effet, pour cause de contraintes réglementaires, un délai a été imposé avant de pouvoir effectuer les expériences et tester l’infectivité des clones, ce qui n’a pas permis d’aller usqu’au bout de nos essais pour l’instant. Le développement et les premiers tests effectués sont cependant importants, car il n’existe à ce jour qu’un seul clone du DWV décrit dans la littérature(Lamp et al., 2016)(Lamp et al., 2016).
DWV isolates
Two isolates were chosen to be purified and cloned in plasmids, one native DWV-A isolate hereby named DWV-Fr1 from one colony with deformed wing symptoms located in the experimental apiary of INRA Avignon (South-Eastern France) and one DWV-A/DWV-B recombinant isolate named RecVT-Fr1 from a Varroa-tolerant colony (Le Conte et al., 2007), from the same location. Both isolates sequences were published under the numbers KX373899 for isolate DWV-Fr1 and KX373900 for isolate RecVT-Fr1 (Dalmon et al., 2017).
Viral purification
DWV was purified from the two different isolates after propagation honeybee pupae. Before propagation DWV-Fr1 was extracted from stored honeybees and RecVT-Fr1 from stored pupae. First, propagation was carried out by serial inoculations, injecting the isolates extracted from honeybees into red-eye pupae, which were kept to multiply the virus for 24 to 48h at 34°C and with saturated humidity. Then purification was carried out using a 30% sucrose cushion followed by a cesium chloride (CsCl) gradient, following the protocol described in (Desbiez and Lecoq, 1997).
Sucrose cushion
First step in sucrose cushion was carried out following protocol from (Ryabov et al., 2009). Briefly, for each isolate, 20 pupae were crushed in 5mL of 0.01 M, pH 7 phosphate buffer (previously prepared by mixing a solution of 0.01 M K2HPO4 (0.23 g + 100 mL distilled H2O) and a solution of 0.01 M KH2PO4 (0.137 g +100 mL H2O)). The sucrose cushion was prepared using a 30% sucrose solution (weight/volume) in distilled water (ΔH2O). The obtained solution was submitted to low speed centrifugation for 15 min at 15 000 g and around 4mL of supernatant was transferred in specific ultracentrifuge bottles. 2 mL of 30% sucrose solution was deposited at the bottom of the bottle using a syringe, and the bottles were equilibrated using phosphate buffer. Samples were centrifuged during 6 h at 4°C, 100 000 g in a Beckman LE-80 ultracentrifuge using a 70.1Ti rotor. The supernatant was eliminated and 4 mL of phosphate buffer was added before agitating on ice overnight to resuspend the pellet.
CsCl gradient
5.48 g of CsCl were added to 4 mL of each resuspended pellet (1.37 g/mL). Samples were centrifuged for more than 16h, at 132 000 g at 4°C using the same rotor as above. The thick white strip that could be seen in each sample was collected using a bevelled syringe. CsCl was eliminated using a protocol adapted from (Ryabov et al., 2009). Samples were diluted to 1/60th in 0.01 M phosphate buffer (0.5 mL of each in 30 mL) and centrifuged for 3 h at 4°C, 30 000 g. The supernatant was eliminated and pellets were resuspended in 500 µL of phosphate buffer, on ice with gentle agitation. Fifty µL of each sample were used to extract RNA for quantification and amplification.
Télécharger le document complet
