Détermination du cholestérol HDL

Détermination du cholestérol HDL

Le cholestérol HDL est déterminé après hydrolyse enzymatique et oxydation. Après précipitation du LDL par l’acide phosphotungstique, l’indicateur coloré qu’est la quinone imine est formé à partir du peroxyde d’hydrogène et de la 4- Aminoantipyrine en présence de phénol et de peroxydase :Elle permet de calculer le taux de LDL à partir du cholestérol total, du HDL et des triglycérides. Elle n’est applicable que si les TG < 4 g/l Pour des concentrations exprimées en mmol/l : Cholesterol LDL = cholesterol total – (chol-HDL+TG/2, 2) Pour des concentrations exprimées en g/l: Cholesterol LDL = cholesterol total – (chol-HDL+TG/5) Valeurs usuelles : 0,83- 1,50 g/lIl y a risque de développer une maladie coronarienne si la valeur du cholestérol LDL est supérieure ou égale aux valeurs usuelles (>1,60g/l).

Détermination des triglycérides

La triglycidérémie est déterminée par la technique enzymatique utilisant le système lipase/glycérol phosphate oxydase/ peroxydase. Les triglycérides présents dans l’échantillon sont hydrolysés par une enzyme (lipoprotéine lipase) en acides gras et glycérol. Le glycérol est ensuite phosphorylé en glycérol 3. Phosphate (G3P) en présence de glycérol Kinase (GK). Le glycérol 3 phosphate oxydé en présence de Glycérol 3 phosphate Oxydase (G3P0) donne un dihydroxyyacétone phosphate et un peroxyde d’hydrogène. Ce dernier réagit avec le 4- chlorophénol et le 4 – aminoantipypirine en présence de peroxydase (POD) pour donner un complexe coloré. L’absorbance de ce dernier à 500-520 nm est directement proportionnelle au taux de triglycérides dans l’échantillon.

Phénotypage de l’haptoglobine

Le phénotypage de l’haptoglobine a été réalisé selon la méthode de Raymond (Raymond, 1962) par électrophorèse en gel de polyacrylamide à 5 %. Pour la préparation de 30 ml de gel, 5 % d’acrylamide/bisacrylamide (Bio-Rad laboratoires, CA, USA) ont été polymérisés avec 0.1 ml de N,N,N,N’- tétraméthylènediamine (TEMED) et 20 mg de persulfate d’ammonium. L’électrophorèse en milieu alcalin a été réalisée en tampon contenant 0,1 mol/L de Tris et 0,09 mol/L d’acide borique, pH 8,6. La préparation consiste à dissoudre 12,14g de Tris dans 800ml d’H2O distillée, 5,56 d’acide borique est ensuite ajouté puis on attenue le pH jusqu’à 8,6.

Plaques de gel de polyacrylamides

Pour couler le gel, des plaques de verre (Glass plates, Bio-Rad laboratories, CA, USA) ont été utilisées sur le système Mini-Protean-II (Bio-Rad laboratories, CA, USA), ce qui permettait d’effectuer simultanément une électrophorèse sur deux gels, soit 16 échantillons en même temps. A 75 μL de chaque échantillon de plasma, ont été ajoutés 75 μL d’une solution d’hémoglobine humaine (1,6 μmol/L) et 50 μL de saccharose (10 g/L). L’ensemble a été incubé pendant 10 min à température ambiante, puis 10 μL de solution de bleu de bromophénol (0,001 %) ont été ajoutés juste avant la migration. Les plaques de gels ont été placées dans le dispositif de migration (Miniprotean II, Bio-Rad laboratories, CA, USA) rempli de tampon dans les conditions permettant une migration correcte. Le mélange plasma-solution d’hémoglobine a été introduit dans les puits situés au niveau de la partie supérieure du gel avant d’appliquer un courant de 200 V pendant 2 heures. Après migration, les gels ont été enlevés avec précaution des plaques de verre et placés dans la solution de révélation des complexes Hp-Hb, contenant 0,2 g de diméthylbenzidine dans 100 mL d’une solution d’acide acétique 0,9 mol/L. Après 2 h d’incubation à l’abri de la lumière, 5 mL d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % (w/v) fraîchement préparée ont été ajoutés à la solution de révélation. Les bandes caractéristiques du complexe Hp-Hb et l’hémoglobine résiduelle sont apparues colorées en vert-brun.

Les analyses ont été réalisées grâce au logiciel Statview en utilisant le test de Mann Whitney pour comparer les variables entre patients et témoins, et le test de Kruskall Wallis pour localiser les différences significatives des variables chez les différents types de phénotypes d’haptoglobine. Une valeur de P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.L’âge des patients varie entre 18 et 68 ans avec un âge moyen de 30,1 ans. Le pic de fréquence se situe dans la tranche d’âge de 20 à 39 ans avec un taux de 71,10 %, suivi de la tranche d’âge de 40 à 59 ans (15,70%). On constate qu’au dessous de 59 ans la fréquence est faible avec un taux < 5%. Pour ce qui est des témoins l’âge moyen est de 29,6 ans. Le pic de fréquence se situe dans la tranche que celui des patients avec un taux de 81,58 %, suivi de la tranche d’âge de 40 à 59 ans avec un taux de 13,16%.On constate une fréquence très faible dans les tranches d’âge de 0 à19 ans et de 60 à 79 ans.