Détermination de la virulence in vitro

Réplication virale et capacités de diffusion des particules infectieuses (Plages de Lyse)

Afin de mieux appréhender la capacité réplicative des différents virus in vitro, une visualisation des plages de lyse formées après infection d’une cellule par une particule infectieuse et diffusion de proche en proche des néo-virions produits a été effectuée (figure 24).Des plages de lyses ont pu être visualisées pour toutes les constructions de virus testées. Pour les virus Is98, It08 et Chimère 3, les plages de lyses étaient morphologiquement identiques. En revanche pour les virus Chimère 4 et Mutant Thr, les plages de lyses étaient très petites Page 86 sur 125 (difficiles à observer pour Chimère 4), voire non visibles à 3 jours post infection pour Mutant Thr (elles sont visibles à 5 jours post-infection, données non montrées) ce qui indique que ces virus présentent une réplication ou une diffusion moins efficace que les 3 autres virus produits, sur des cultures de cellules VERO. 

Cinétiques d’infection 

Afin de vérifier l’hypothèse énoncée précédemment, une cinétique d’infection sur des cellules VERO avec les différents virus a été réalisée et les surnageants des cellules infectées ont été analysés par RT-qPCR (figure 25). Cette expérience nous permet de décrire la multiplication virale dans le temps pour les différents virus testés La RT-qPCR réalisée nous a permis de comparer les cinétiques de réplication des virus Is98, It08, Chimères 3, 4 et Mutant Thr (comparativement à Is98 ou WT Pro pour ce dernier). Les différents virus testés ont présenté des cinétiques de réplication comparables et ce quel que soit la MOI considérée (figure 25 et données non montrées). A J1 post infection, la quantité d’ARN viral détectée dépendait de la MOI utilisée (environ 1 Log de variation entre les conditions expérimentales testées, en accord avec la différence d’1 Log entre les MOI utilisées) (données non montrées pour les MOI de 1 et de 0.01). La quantité d’ARN viral a augmenté jusqu’à J2 postinfection, pour tous les virus, et était identique pour les différents virus et différentes MOI évalués (différence non significative entre les virus. Test de 2way ANOVA et post test de Tukey, logiciel Graphpad Prism), puis le nombre de copies d’ARN viral est resté constant entre J2 et J3 postinfection (système d’amplification à saturation). Les deux chimères, ainsi que le mutant semblent se comporter comme les virus référents Is98 et It08. De ce fait, ce test ne nous permet pas d’observer un défaut de réplication de la chimère 4, ni du mutant Thr par rapport aux trois autres virus.Pour compléter les résultats de la RT-qPCR, un titrage des particules infectieuses en DECP50 a été réalisé afin de mesurer le pouvoir infectieux des particules virales produites dans le surnageant des cellules infectées avec les différentes productions virales (figure 26) Un jour après l’infection des cellules, les titres viraux étaient comparables pour les chimères 3 et 4, It08 et Is98 à 0.01 MOI et à 0.1 MOI (Différence non significative en Test 2way ANOVA, et post test de Tukey de Graphpad Prism). Par contre, à la MOI de 1, une différence significative (Test 2way ANOVA et post test de Tukey de Graphpad Prism) a été identifiée entre la souche It08 et Is98. En effet la souche It08 semble mieux se répliquer qu’Is98. Les souches chimères semblent adopter un comportement plus semblable à It08 qu’à Is98. Un effet de la dose d’infection sur le titre infectieux des surnageants à J1 post-infection a été observé pour tous les virus testés. Plus les MOI étaient élevées, plus les surnageants prélevés à J1 post-infection comportaient de particules infectieuses (figure 26 A). A J2 post-infection, pour les MOI de 0.01 et 1, les différents virus semblent également se répliquer de façon comparable (pas de différence statistique significative, test 2way ANOVA et post test de Tukey, Graphpad Prism). Par contre à la MOI de 0.1, Is98 semble se comporter différemment des autres virus (Différence significative, test 2way ANOVA et post test de Tukey de Graphpad Prism), avec un titre infectieux significativement plus élevé que pour les autres virus étudiés. Les chimères ont toujours une réplication comparable à It08. On peut également observer un ralentissement de la réplication virale et une perte de l’effet dose à J2 post-infection (titre constant quel que soit la MOI) (figure 26 B). Dans les conditions expérimentales testées, la réplication virale évaluée à partir de la mesure du titre infectieux dans les surnageants des cultures infectées, présente généralement une efficacité comparable pour Is98, It08, Chimères 3 et 4. A l’époque des travaux sur le mutant NS3 mutant Thr, les données de réplication par évaluation du titre infectieux n’ont pas été collectées. 

Détermination de la virulence in vivo : expérimentation animale 

Des tests in vivo permettant de reproduire plus précisément la pathogénie des infections virales et d’étudier plus finement les déterminants de virulence ont été réalisés. D’une part un modèle murin, la souris BALB/cByJ, très utilisée pour les tests d’infection avec le VWN, a été choisi, car il reproduit les infections neuro-invasives observées chez les mammifères (homme et cheval) (187). D’autre part un modèle aviaire, le poulet SPF de 1 jour, a été retenu car il reproduit les infections neuro-invasives observées chez les hôtes aviaire

Importance du résidu 249 de NS3 dans la modulation de la virulence du VWN chez la souris 

Suivi de mortalité des souris

 Pour vérifier l’importance que la modification du résidu 249 de NS3 pouvait avoir dans la modulation de la virulence du VWN chez l’hôte mammifère, j’ai infecté des souris avec deux virus issus de constructions ne se différenciant que par la mutation de ce résidu : WTPro : Clone infectieux séquence sauvage (NS3-249Pro) Mutant Thr : Clone infectieux séquence sauvage avec mutation NS3-249Thr Les souris infectées par voie IP avec le clone infectieux WT Pro sont mortes de l’infection selon un schéma classique, les décès se produisant entre le jour 8 et le jour 12 post-infection (tableau 16A), tandis que les souris infectées par le mutant Thr ont survécu à l’infection à l’exception d’un individu à la dose 1 PFU décédé à 16 jours post-infection (p-i) ; plus de mortalité et de symptômes cliniques ont été induits, de façon significative dans les groupes 10 et 100 MOI avec le virus WT Pro. Les symptômes cliniques observés dans les groupes WT Pro comprenaient le poil hirsute, la prostration, les tremblements involontaires des muscles et la paralysie des membres postérieurs. En outre, la perte de poids a été rapidement induite lors de l’infection par le virus WT Pro (6.5-7.5 jours p-i). Lorsque les souris ont été infectées par voie IC, les signes cliniques et les profils de mortalité ont été comparables pour les deux virus (tableau 16B), même si une différence significative des taux de mortalité pour une dose inoculée de 1 MOI a été identifiée (à cette dose d’inoculation, les temps de survie et le délai d’apparition des premiers symptômes à savoir la perte de poids étaient similaires). Cependant, les souris infectées par le virus mutant Thr sont mortes plus tardivement (7, 7 et 11 jours p-i, temps de survie moyen de 8.3) alors que les souris infectées par WT Pro meurent massivement entre le jour 7 et 8 p-i (temps de survie moyen de 7.4 jours). Le potentiel neuro-invasif du virus WT Pro apparait plus élevé que celui du virus mutant Thr dans mon étude sur modèle murin, alors que la neurovirulence de ces deux souches est comparable. Les essais ont été réalisés deux fois de manière indépendante.

Virémie des souris

La virémie moyenne a été estimée à J4 p-i par quantification de l’ARN viral dans les prélèvements sanguins (qRT-PCR 3’NC).Celle-ci était significativement plus élevée (p <0,05) dans les groupes WT Pro 10 et 100 PFU IP que dans les groupes mutant Thr respectifs, et un pic de virémie a été mesuré pour une dose d’inoculation de 10 PFU de WT Pro par voie IP (figure 27). Aucune virémie n’a été détectée dans les groupes WT Pro et mutant Thr 0,1 PFU IP. Page 92 sur 125 Chez les souris infectées par 1 PFU de virus par voie IC, la virémie a été détectée avec un niveau significativement plus élevé (p <0,05) dans le groupe WT Pro que dans le groupe mutant Thr. Les différences observées dans les taux de virémie entre les groupes WT Pro et mutant Thr se sont traduites par des différences dans l’induction de l’immunité innée, telle que déterminée par la mesure de l’interféron alpha sérique (IFN-α) avec le kit ELISA de détection de l’IFN alpha murin (Mouse IFN Alpha ELISA Kit ; PBL Assay Science) (données non montrées). L’IFN-α n’était pas détectable dans les groupes infectés avec les doses de 0,1 et 1 PFU IP de virus aux jours 2 et 7 post-infection. Un pic a été mesuré pour le groupe 10 PFU IP WT Pro à ces deux dates alors que les niveaux d’IFN-α étaient plus faibles pour la dose d’inoculation de 100 PFU (virémie plus faible également, voir figure 27A). Les taux d’IFN-α étaient globalement plus faibles au jour 7 p-i qu’au jour 2 p-i pour les groupes WT Pro. Les niveaux d’IFN-α n’étaient pas détectables pour aucun groupe d’infection aux jours 2 et 7 p-i pour les souris infectées par le virus mutant Thr. La multiplication périphérique, mesurée au pic de virémie, apparaît plus élevée pour le virus WT Pro que pour le mutant Thr.