Dénombrement de Flore Aérobie Mésophile Totale ou FAMT

Dénombrement de Flore Aérobie Mésophile Totale ou FAMT

La flore mésophile aérobie totale est l’ensemble des micro-organismes aptes à se multiplier aux températures moyennes, plus précisément ceux dont la température optimale de croissance est située entre 25 à 40°C. Ils peuvent être des micro-organismes pathogènes ou d’altération. Le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale est réalisé selon la norme Française NF V 08-51. La flore aérobie mésophile totale (FAMT) est un indicateur sanitaire qui permet d’évaluer le nombre d’UFC (Unité Formant une Colonie) présent dans un produit ou sur une surface. Le principe consiste à compter l’ensemble des bactéries capables de croître sur le milieu PCA, après un ensemencement des dilutions décimales et incubation en aérobiose à 30°C. 

Ensemencement

La culture se fait en profondeur, un volume de 1 ml de la solution mère ou des dilutions décimales ont été déposés dans des boites de Pétri stériles à l’aide de pipettes stériles. Une quantité de 15 ml de milieu PCA refroidie à 45°C a été coulés dans chaque boite de Pétri. L’inoculum est soigneusement mélangé au milieu de culture par des mouvements circulaires et de va-et-vient sur une surface fraîche et horizontale. Après solidification, les boites ainsi préparées ont été retournées puis incubées dans une étuve réglée à 30°C pendant 72h. 3.2 Comptage Le comptage des colonies de FAMT de couleur blanche a été effectué sur la boite de Pétri après la période d’incubation. Les boites retenues sont comprises entre 15 à 300 colonies car il est impossible de compter une boîte contenant plus de 300 colonies en raison d’un risque d’erreur trop important. Ces résultats sont donc rejetés. Les boîtes contenant moins de 15 colonies sont elles aussi écartées, car les colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur

Mode calcul ISO 7218

Le nombre de microorganismes par gramme de produit au niveau de deux dilutions successives a été calculé à l’aide de la formule suivante : Où : Σc est la somme de colonies comptées sur les 2 boites de Pétri retenues. d est le taux de dilution correspondant à la première dilution. 4. Dénombrement de staphylocoque à coagulase positif 37°C Le dénombrement de staphylocoque à coagulase positif 37°C a été réalisé selon la norme Française NF EN ISO 68882 (AFNOR, 1999). Parmi les staphylocoques présumés pathogènes, Staphylococcus aureus est recherché. Le milieu Baird Parker (BP) auquel on ajoute du RPF ou Rabbit Plasma Fibrinogen a été utilisé. L’ajout de RPF nous permet de réaliser le comptage direct des colonies caractéristiques sans faire les tests de confirmation, car il permet de déterminer l’activité de l’enzyme coagulase.

Ensemencement

Apres le coulage du milieu dans des boîtes de Pétri, un ensemencement en surface de 1ml de l’inoculum est fait à la surface du milieu de culture. Les colonies de Staphylococcus aureus apparaissent noires brillant, bombées et entourées d’un halo clair. Le dénombrement est réalisé en 2 exemplaires, et l’incubation s’effectue à 37°C pendant 24heures. 

Comptage

Après l’incubation, les colonies caractéristiques de staphylocoques de couleur noire entouré par un halo ont été comptées pour chaque échantillon. Seules les boites percutant entre 15 à 300 colonies sont retenues. N = 22 4.3 Mode de calcul ISO 7218 Selon ISO 7218 (mai 1996), le nombre total de colonies présentes dans l’unité d’échantillonnage est calculé à l’aide de la formule suivante : Ou : N : nombre de colonies (UFC/g) ΣC : nombre total des colonies sur les boîtes retenues n1 : nombre de boîtes comptées à la première dilution retenue la plus faible. n2 : nombre de boîtes comptées à la première dilution retenue. d : Facteur de dilution à partir duquel le premier comptage est réalisé : dilution la plus faible. V : volume de la prise d’essai inoculé en ml Vsm : volume de la suspension mère en ml. Vpr : volume de produit (ml) ou masse de produit (g) ou surface de produit (cm2) ayant constitué la suspension mère.

Recherche de Salmonella spp

Elle est effectuée selon la norme AFNOR V-08-052-1993. La recherche des Salmonelles consiste en la détermination de la présence ou de l’absence du genre Salmonella dans 25g de produit (ici viande de poulet de chair). Quatre étapes sont à distinguer: 

Le pré-enrichissement

Un milieu de revivification (Eau Peptonnée Tamponnée ou EPT) a été mélangé avec le prélèvement de viande, le tout étant incubé à 37°C pendant 24heures. Cette phase permet aux bactéries lésées de récupérer l’ensemble de leurs potentialités. 

L’enrichissement

Pour l’enrichissement sélectif des salmonelles, le milieu utilisé est le bouillon de Rappaport Vassiliadis Soja (RVS). Ces derniers peuvent s’y multiplier grâce à la présence de vert malachite et de chlorure de magnésium. Un volume de 10 ml de RVS a été mis dans un tube auquel 0,1ml du milieu de pré-enrichissement précédent est ajouté. Les tubes ont été incubés à 42 °C ± 1°C pendant 24 heures. 5.3 L’isolement Pour l’isolement, deux milieux ont été utilisés : la gélose Hektoen Enteric Agar ou HEA et la gélose Xylose Lysine Tergitol 4 ou XLT4. Les milieux XLT4 et HEA présentent, entre autre, trois sucres (lactose, saccharose et xylose pour XLT4, lactose, saccharose et salicine pour HEA) (DELARRAS, 2007; JOFFIN et al., 2006) dont les dégradations font changer la couleur des géloses grâce à un indicateur de pH (rouge de phénol pour le premier, bleu de bromothymol et fuchsine acide pour le second). Il permet de mettre en évidence une alcalinisation due à l’utilisation du citrate comme source de carbone par les salmonelles. La gélose Xylose Lysine Tergitol 4 (XLT4) augmente la fréquence de détection des Salmonella non-Typhi à partir de prélèvements d’origine avicole contenant une microflore secondaire importante, et que le milieu permet une bonne différenciation entre Salmonella et Citrobacter. Le milieu décrit par ces auteurs incorporait le Tergitol 4 dans une base Xylose Lysine, modifiée pour inhiber un grand nombre de microorganismes (Proteus, Pseudomonas, Providencia) qui interféraient auparavant sur la détection des Salmonella. (MILLER et al., 1991). Après refroidissement et solidification du milieu gélosé, la culture pré-enrichie sur le bouillon RVS a été repiquée. L’ensemencement est réalisé par la méthode des stries d’épuisement avec une anse d’inoculation. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures. Après 18h à 24h d’incubation, les boîtes ont été observées, afin de rechercher la présence des colonies typiques de Salmonella. Les colonies de Salmonella sont de couleur vert à centre noir sur le milieu HEA. Et pour le milieu XLT4, les colonies de Salmonella typiques (H2S-positif) sont rouges à centre noir, En effet, de telles colonies étaient suspectées d’appartenir à des salmonelles car incapables d’utiliser les sucres en présence et souvent capables de produire du H2S (JOFFIN et al., 2006). Elles peuvent présenter un halo jaune après 24 heures d’incubation. En cas d’incubation prolongée, les colonies deviennent rouges à roses à centre noir ou 24 entièrement noires. Les colonies de Salmonella H2S-négatif apparaissent rouges à roses, sans centre noir. 5.4 L’identification Plusieurs milieux d’identification sont utilisés pour la recherche des caractères biochimiques des salmonelles. Les colonies suspectes de Salmonella peuvent être soumises à quelques tests d’identification appartenant à la galerie classique :  Le milieu Kligler-Hajna Les colonies retenues lors de la précédente étape étaient repiquées sur milieu Kligler-Hajna avec une anse de platine. En pratique, ce milieu était coulé penché afin d’avoir une large pente et un culot suffisant (2-3cm d’épaisseur). Ainsi, il permettait de mettre en évidence l’utilisation du glucose et du lactose par les bactéries ainsi que leurs capacités à produire du gaz et du H2S. En effet, le jaunissement du culot, après passage à l’étuve, indiquait que la bactérie pouvait utiliser le glucose, tout comme celui de la pente pour le lactose. Un décollement de la gélose indiquait quant à lui une production de gaz par la bactérie. Enfin, une coloration noire de la gélose signifiait que celle-ci pouvait produire du H2S (figure 24) (JOFFIN et al, 2006; QUINN et al., 1994).  Le Milieu Lysine Décarboxylase Ce test permettait de déterminer si la bactérie testée pouvait produire de la cadavérine par action de la lysine décarboxylase. La colonie à étudier était ensemencée sur la pente de la gélose LYS à l’aide d’une anse de platine. Ici, une réaction positive se traduisait par un trouble et une coloration violette du milieu. A l’inverse, une réaction négative se traduisait par une coloration partiellement jaune de ce dernier (JOFFIN et al., 2006) (figure 23).  Le milieu urée –indole.  Le milieu de Simmons.