Données toxicologiques et écotoxicologiques

Impact sur l’environnement

Suite à une demande des producteurs de 2-EHN et aux contraintes imposées par la directive européenne REACH, les propriétés de biodégradabilité du 2-EHN ont été étudiées selon un protocole standard par mesure du CO2 dans l’espace de tête de la fiole de test. C’est en octobre 2006 qu’un rapport demandé par les entreprises adhérant à l’HERTG (The Health, Environmental, and Regulatory Task Group) a rendu compte des critères de dégradation du 2-EHN. Il s’avère que ce dernier n’est pas biodégradable selon les tests normalisés (The American Chemistry Council Petroleum additives panel, 2006). En cas d’accident ou de déversement accidentel, il existe donc un risque depollution rémanente de l’environnement par le 2-EHN. C’est un composé de faible solubilitédans l’eau qui forme une émulsion en solution aqueuse. Il peut aussi former un film sur l’eau et ainsi faire barrière au transfert d’oxygène et limiter la vie d’organismes aérobie. Le coefficient de répartition octanol/eau (KO/W) est élevé, on peut ainsi en déduire que le 2-EHN a une mobilité réduite en milieu aqueux et qu’il s’adsorbe modérément aux particulesde terre et de sédiments. De plus, il est très volatil à température ambiante et de ce fait peu accessible aux microorganismes. Ces dernières remarques se basent sur des hypothèses formulées par l’ATC. Ces hypothèses reposent sur les propriétés de biodégradabilité d’hydrocarbures dont les propriétés physicochimiques sont voisines de celles du 2-EHN.

Ecotoxicité

Les propriétés d’écotoxicité du 2-EHN sont connues.Le 2-E HN est faiblement toxiquepuisque les LC50 (dose létale pour 50 % de la population) vis-à-vis du poisson Zebra (Danio rerio ), de la daphnie (Daphnia magna ) et des algues (Selenastrum capricornutum ) sont supérieures à sa solubilité dans l’eau à 20°C (soit12,6 mg.L -1 ).(www.epa.gov/HPV/pubs/summaries/nitracd2/c14932tp.pdf).

Toxicité

La toxicité orale a été testée par une injection (10 mL/kg) de 2-EHN dans le système gastrique de rats. Après 14 jours, sur cinq animaux testés, deux sont morts, les autres ont présenté des nécroses et ont été euthanasiés (ATC 2004). Une autre étude sur les effets neurochimiques du 2-EHN chez le rat, menée par Someroja et Savolainen (Someroja & Savolainen, 1983) a montré que le 2-EHN a les mêmes effets, d’un point de vue pharmacologique, que la nitroglycérine i.e.la vasodilatation des vaisseaux sanguins.
La toxicité dermatologique du 2-EHN a été testée sur des lapins (Albinos) à la dose de 5 mL.kg -1 . La fourrure et l’abdomen des animaux ont été sévèrement irrités. Aucun signe de toxicité n’a cependant été observé après 14 jours (ATC, 2004). Le 2-EHN a les mêmes effets que la nitroglycérine sur l’homme, à savoir la vasodilatation des vaisseaux sanguins. Une simple exposition au 2-EHN peut causer des céphalées graves, des faiblesses, des étourdissements, des rougeurs de lapeau, de l’hypotension et des palpitations. Le 2-EHN est un contaminant pour l’environnement, de plus il est à l’origine de trouble pour la santé. L’étude de sa biodégradabilité est ainsi justifiée. Pour ce faire, il est importantde comprendre comment les micro-organismes peuvent accéder à ce substrat hydrophobe et volatil.

Accession des microorganismes aux composés organiques hydrophobes

Certains microorganismes utilisent les hydrocarbures comme source de carbone pour leur croissance. De ce fait, ils se sont adaptés en termes de résistance et d’équipement enzymatique pour utiliser ce type de substrat. Les hydrocarbures sont des composés hydrophobes dont la solubilité diminue à mesure que la masse moléculaire des composés augmente. Pour les hydrocarbures dont la solubilité est faible (< 0,1 g.L -1 ), les microorganismes ont développé des stratégies pour venir au contact du substrat. Quatre modes d’accession, illustrés dans la figure 1.2 ont été avancés pour expliquer l’assimilation des hydrocarbures par les microorganismes (Bouchez-Naitaliet al. , 1999; Hommel, 1994).

Voie du citronellol et alcanes β-substitués

Les antéiso-alcanes (ß-substitués) sont rarement oxydés en raison de la présence d’un carbone quaternaire bloquant la voie classique de la β-oxydation (croix bleue sur la figure 1.6). En effet pour les 3-alkylacyl-CoA, la β-oxydation est bloquée après l’étape d’hydratation. Ce problème se pose aussi pour les terpénoïdes comme le citronellol, le géraniol et le nérol. Il est ici résolu chez certains micro-organismes par carboxylation du groupement méthyle concerné et élimination du groupement carboxyméthyle formé.
Cette voie a été initialement découverte par Seubert et ses collègues chez Pseudomonas citronellolis capable de dégrader le citronellol (Seubert & Fass, 1964) et a été ensuite rapporté chez d’autres Pseudomonas (Forster-Frommeet al. , 2008).Selon Fall et al . (1979), les voies de dégradation du citronellol et des 3-méthylalcanes se rejoignent. Ils proposent ainsi que la dégradation d’un 3-méthylalcane se fasse initialement par la voie de dégradation des alcanes (formation d’un acide carboxylique) puis ensuite par la voie de dégradation du citronellol et se termine par β-oxydation classique.

Alcanes polyméthylés récalcitrants à la biodégradation

Du fait du mécanisme particulier de dégradation des alcanes β-substitués, ladégradation des alcanes polyméthylés dépend de la capacité à attaquer des branc hements méthyles en position 2. Ainsi, (Schaefferet al. , 1979) rapportent que la présence de structures anteiso aux deux extrémités de l’hydrocarbure rend la molécule totalement récalcitrante alors que les structures iso ralentissent l’oxydation par rapport à la molécule linéaire correspondante. Ces observations basées sur des tests de croissance sur des isomères d’octane disubstitués (diméthyloctanes) et avec des micro-organismes sélectionnés sur octane, ne sont cependant pas généralisables aux micro-organismes dotés de la voie du citronellol. Par exemple, des micro-organismes capables de dégrader des isoalcanes peuvent parfois s’attaquer à des alcanes substitués. C’est le cas de Mycobacterium austroafricanum IFP 2173, isolée pour sa capacité à dégrader l’iso-octane (Solano-Serenaet al. , 2000b) et qui dégrade totalement de façon similaire les 2,5- et 3,4-triméthylpentane (voir § 5.2.2). Cependant, les isoalcanes possédant des atomes de carbone substitués consécutifs, comme le 2,3,4 triméthylpentane, sont résistants à la biodégradation (Solano-Serenaet al. , 1999).

Les alcane-1 monooxygénases (E.C. 1.14.15.3).

Les alcane monooxygénases sont responsables de l’attaque initiale de l’alcane qui est converti en son alcool correspondant par le biais d’une oxydation du carbone à l’extrémité terminale ou subterminale. Le système enzymatique hydroxylase catalysant cette réaction estgénéralement couplé à un système transporteur d’électrons. En fonction de la longueur dechaîne des alcanes, différents systèmes d’enzymes sont impliqués (tableau 1.2).
Les enzymes de type méthane monooxygénase oxydent les alcanes composés de 1 à 10carbones. Deux formes de cette enzyme ont été déc rites : la méthane monooxygénase particulaire (pMMO) et la méthane monooxygénase soluble (sMMO). La pMMO est une enzyme membranaire synthétisée chez la plupart des bactéries méthanotrophes qui fonctionne avec un centre fer-cuivre où elle oxyde les alcanesde C 1à C 5 . Alors que la sMMO est une enzyme soluble oxydant les alcanes de C 1 à C 10. (Ayala & Torres, 2004; Deeth & Dalton, 1998).

Présence et redondance dans les génomes bactériens

Une analyse des homologies de séquence peptidique au niveau du site actif du CYP153 est représentée sur la figure 1.19. La région comparée est comprise entre le site de fixation du substrat proche de l’hélice I et la séquence terminale de fixation de l’hème par la cystéine en position axiale. (Voir § suivant pour la structure).
La plupart des séquences analysées correspondent à la sous-famille des CYP153A. Cinq autres CYP153 appartiennent aux sous-familles C, D ou E. La séquence la plus éloignée est celle de Novosphingobium aromaticivoransCYP153C1 qui a entre 38 et 43% d’identité avec les autres séquences de CYP153.

Structure

Puisque les tentatives de cristallisation du CYP153 ont été infructueuses, une modélisation de la structure a été réalisée par Funhoff et al. (2006) (figure 1.20). Le modèle obtenu révèle que le site actif du CYP153 a une nature hydrophobe, ce qui est le cas d’autres CYPs. C’est aussi ce qu’avait supposé Maier en 2001en observant la nature hydrophobe des acides aminés composant la première hélice α du cytochrome P450 de Acinetobacter sp.
EB104. Dans ce cas, la réaction catalysée prend place dans une poche catalytique de nature hydrophobe. Ce qui facilite le passage du substrat.

Dégradation de xénobiotiques récalcitrants par Mycobacterium

Taxonomie et description du genre Mycobacterium

Taxonomie et phylogénie

Les mycobactéries (genre Mycobacterium) sont des bactéries à Gram faiblement positif (Hartmanet al. , 2006) appartenant à l’ordre des Actinomycètes quiregroupe aussi les genres Nocardia , Corynebacteriumet Rhodococcus. Les bactéries appartenant à ces différents genres ont en commun un certain nombre de caractéristiques : le métabolisme est de type aérobie, le pourcentage de bases G+C dans l’ADN est élevé (66 à 71 mol % pour les mycobactéries), leur paroi cellulaire contient des acides mycoliques. Ces derniers peuvent, chez les mycobactéries, comporter 60 à 90 atomes de carbone et confèrent aux cellules un caractère hydrophobe.
Les mycobactéries sont non mobiles, ne sporulent pas et se présentent, à l’observation microscopique, sous forme de bacilles droits ou incurvés plus ou moins branchés, ou de coccobacilles. Les colonies sont lisses ou rugueuses, parfois colorées en jaune ou en orange (présence de caroténoïdes).
Les mycobactéries sont largement présentes dans l’eau et les sols. C’est l’un des 14 genres bactériens les plus abondants des sols, puisqu’ils représentent 2,6 % des communautés microbiennes totales (Floydet al. , 2005). Le genre Mycobacteriumest le seul représentant de la famille des Mycobacteriaceae . Les espèces incluent des bactéries pathogènes ou saprophytes et sont généralement réparties en deux sous-divisions : les mycobactéries « à croissance rapide » et les mycobactéries « à croissance lente », le temps de génération pouvant varier, selon l’espèce, de deux à plus de vingt heures. Mais, il est aussi possible de classer ces bactéries en trois groupes : celles qui sont pathogènes pour l’homme et les animaux, celles qui dégradent les hydrocarbures aromatiques polycycliques et celles qui sont associées à aucune des catégories précédemment citées (Hartman et al. , 2006). Les Mycobactéries suscitent un intérêt particulier pourleur aptitude à dégrader certains polluants et ainsi pour leur implication dans l’atténuation naturelle et la bioremédiation des sites pollués.
L’identification des mycobactéries est réalisée surla base de séquences des ARNr 16S pour une identification du genre. Comme les séquences des ARNr sont très proches voire identiques, on a recours aux séquences des gènes hsp65et rpoBpour une identification plus fine de l’espèce. Le gène hsp65(Ringuetet al. , 1999) code pour la protéine chaperone Hsp 65 présente chez toutes les bactéries et essentielle pour la résistance à des stress environnementaux. Le gène hsp 65 possède deux régions hyper-variables dans lesquelles il semble moins conservé que l’ARNr 16S. Le gène rpoBcode pour la sous unité βde l’ARN polymérase ; il est aussi moins conservé que l’ARNr16S et les différences de séquence sont utiles pour classer les espèces (Adekambi et al. , 2003). La méthode la plus commune de caractérisation est l’analyse RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) discriminant différentes souches ou clones grâce aux différentestailles d’amplification PCR obtenues sur la région intergénique 16S-23S. Cette méthode est la plus utilisée actuellement pour l’identification des mycobactéries. Elle permet l’identification des mycobactéries « à croissance rapide » grâce à la combinaison des séquences des gènes de l’ARNr 16S et desgènes hsp 65et rpoB (Wanget al. , 2006).
Une étude a permis d’isoler des souches de Mycobacterium issues de sols contaminés par divers hydrocarbures et PCB. Pour récupérer les souches de mycobactéries, une culture des microflores en présence d’amibes a permis d’isoler les bactéries. Les amibes servent de réservoir protecteur pour protéger les souches de mycobactéries du stress environnemental et de la toxicité du milieu (Wang et al. , 2006). Plusieurs souches de mycobactéries ont été isolées de ces sols et elles ont été identifiées sur la base de ARNr 16S et des gènes hsp 65et rpoB. Les bactéries isolées sont proches des souches de M. vabaalenii, de M. austroafricanum , de M. chlorephenolicum et de M. frederickbengense (ceci est montré par une annotation sur la figure 1.25).

Table des matières

INTRODUCTION
ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1 Le 2-éthylhexyl nitrate 
1.1 Propriétés physico-chimiques
1.2 Données toxicologiques et écotoxicologiques
1.2.1 Impact sur l’environnement
1.2.2 Ecotoxicité
1.2.3 Toxicité
2 Accession des microorganismes aux composés organiques hydrophobes
2.1 L’assimilation des hydrocarbures solubles
2.2 L’accession interfaciale
2.3 L’accession interfaciale facilitée (émulsification)
2.4 Le transfert micellaire
3 Biodégradation des hydrocarbures aliphatiques 
3.1 Les alcanes linéaires
3.2 Les alcanes ramifiés
3.2.1 Substrats utilisés par la β-oxydation
3.2.2 Cas du pristane et phytane : Alcanes polyméthylés
3.2.3 Voie du citronellol et alcanes β-substitués
3.2.4 Alcanes polyméthylés récalcitrants à la biodégradation
3.2.5 Dégradation du di-2-éthylhexyl phtalate
4 Systèmes enzymatiques de dégradation d’alcanes ramifiés 
4.1 Les alcane-1 monooxygénases (E.C. 1.14.15.3)
4.1.1 Les méthane monoxygénases solubles sMMO
4.1.2 Les hydroxylases de type AlkB (E.C 1.14.15.3)
4.1.2.1 Propriétés générales
4.1.2.2 Diversité des gènes alkB d’origine bactérienne
4.1.2.3 Organisation génétique des gènes alkB
4.1.2.4 Spécificité
4.1.3 Les monooxygénases de type cytochromes P450
4.1.3.1 Classification des cytochromes P450
4.1.3.2 Réactions catalysées
4.1.3.3 Les cytochromes P450 de la famille des CYP153
4.1.3.3.1 Fonction des CYP153
4.1.3.3.2 Présence et redondance dans les génomes bactériens
4.1.3.3.3 Structure
4.1.4 CYP153 ou AlkB ? : L’exemple de Alcanivorax borkumensis SK2
4.2 Les oxidoréductases (E.C. 1).
4.2.1 Les alcool déshydrogénases (E.C. 1.1.)
4.2.1.1 Les ADH utilisant le NAD(P)+comme accepteur d’électrons (E.C. 1.1.1.)
4.2.1.2 Les alcool déshydrogénases NAD(P)-indépendantes (E.C. 1.1.[2-3-4-5-99])
4.2.1.3 Une famille particulière, les flavoprotéines
4.2.2 Les aldéhyde déshydrogénases (E.C. 1.2)
4.2.2.1 Fonction
4.2.2.2 Classification
4.3 Les estérases (E.C.3.1.1.x)
4.3.1 Mécanisme d’hydrolyse de l’ester
4.3.2 Classification des estérases
4.4 Les enzymes de la β-oxydation
5 Dégradation de xénobiotiques récalcitrants par Mycobacterium 
5.1 Taxonomie et description du genre Mycobacterium
5.1.1 Taxonomie et phylogénie
5.1.2 Description de l’enveloppe des mycobactéries
5.2 Mycobactéries dégradant des polluants
5.2.1 Dégradation des n-alcanes par Mycobacterium
5.2.2 Dégradation d’un alcane branché par M. austroafricanum IFP 2173
PRESENTATION DU TRAVAIL
1 Sélection de microflores et souches bactériennes compétentes
2 Elucidation globale des voies de dégradation du 2-EHN
3 Identification des enzymes induites lors de la croissance sur 2-EHN
4 Recherche et expression des gènes d’intérêts
MATERIELS ET METHODES 
1 Méthodes microbiologiques 
1.1 Milieu de culture
1.1.1 Milieu minimum salin extrait de levure (MMSYE)
1.1.2 Milieu complet
1.1.3 Milieu Middlebrook 7H9 et 7H10, pour la culture des mycobactéries
1.1.4 Milieu PTYG : Peptone-Tryptone-Yeast extract-Glucose medium
1.2 Souches et plasmides
1.2.1 Microorganismes
1.2.2 Plasmides utilisés
1.3 Tests de biodégradation aérobie
1.3.1 Mise en œuvre du test
1.3.2 Expression des résultats
1.3.2.1 Taux de recouvrement abiotique
1.3.2.2 Taux de dégradation
1.3.2.3 Rendement de minéralisation
1.3.3 Suivi cinétique de la consommation d’oxygène par respirométrie
2 Méthodes d’analyses physicochimiques 
2.1 Méthodes chromatographiques
2.1.1 CO2
2.1.2 2-EHN
2.1.3 GC-MS
2.1.4 HPLC couplée à un détecteur MS/MS
2.2 Dosage du carbone organique dissous
2.3 Méthodes de dérivation
2.3.1 Préparation de l’échantillon
2.3.2 Estérification
2.3.2.1 En milieu acide
2.3.2.2 En milieu alcalin
2.3.3 Silylation
3 Méthodes de biologie moléculaire 
3.1 Extraction d’ADN génomique de Mycobacterium
3.2 Dosage des acides nucléiques
3.3 Réactions d’amplification par PCR
3.4 Clonage de fragments d’ADN
3.4.1 Purification de fragments d’ADN
3.4.2 Préparation du vecteur de clonage
3.4.3 Utilisation du kit de clonage pDrive
3.4.4 Ligation et clonage
3.4.4.1 Ligation
3.4.4.2 Préparation des cellules compétentes
3.4.4.3 Transformation des cellules compétentes
3.4.4.4 Sélection des clones positifs par PCR sur colonie
3.4.4.5 Extraction de plasmides
3.4.4.6 Vérification de la présence de l’insert dans les plasmides par digestion
3.5 Transformation de Mycobacterium smegmatis
3.5.1 Préparation de cellules compétentes
3.5.2 Transformation par électroporation et sélection destransformants
3.6 PCR couplée à la transcription inversée
3.6.1 Méthode d’extraction des ARN totaux de souches de Mycobacterium
3.6.2 PCR couplée à la transcription inversée (RT-PCR)
4 Méthodes biochimiques 
4.1 Préparation des extraits protéiques
4.1.1 Extraits bruts
4.1.2 Fractions soluble et membranaire
4.1.3 Dosage des protéines
4.1.4 Isolement rapide de protéines par chromatographie d’affinité de type IMAC
4.2 Analyse des protéines par électrophorèse
4.2.1 Gels SDS PAGE
4.2.1.1 Gels Glycine-SDS-PAGE
4.2.1.2 Gel Tricine-SDS-PAGE
4.2.2 Electrophorèse bidimensionnelle
4.2.2.1 Préparation des échantillons pour la première dimension
4.2.2.1.1 Dialyse des extraits solubles de protéines
4.2.2.1.2 Hydratation des bandelettes avec l’extrait protéique
4.2.2.2 Isoelectrofocalisation (IEF)
4.2.2.3 Equilibration des bandelettes pour la deuxième dimension
4.2.2.4 Deuxième dimension
4.2.3 Coloration au bleu colloïdal
4.2.4 Découpage des gels d’électrophorèse
4.3 Analyse LC-MS-MS des spots
4.4 Activité sur gel d’électrophorèse
4.4.1 Activité estérase
4.4.2 Activité peroxydase
4.5 Western Blot
5 Outils bioinformatiques 
RESULTATS
1 Sélection de souches dégradant le 2-EHN
2 Dégradation du 2-EHN par M. austroafricanum IFP 2173 
2.1 Cinétique de la dégradation du 2-EHN par M. austroafricanum IFP 2173
2.1.1 Influence du substrat de préculture
2.1.2 Influence du mode d’apport du 2-EHN
2.1.3 Influence de la température
2.2 Étude préliminaire de la voie de dégradation
2.2.1 Étude du système d’attaque du substrat
2.2.2 Utilisation du 2-EHN comme source d’azote
2.2.3 Dégradation du 2-éthylhexanol et de l’acide 2-éthylhexanoïque
2.2.4 Essais de dérivatisation de l’intermédiaire accumulé
2.3 Voie catabolique du 2-EHN
3 Analyse protéomique des enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN par M.austroafricanum IFP 2173
3.1 Stratégie d’analyse protéomique
3.1.1 Analyse des protéines induites sur 2-EHN
3.1.1.1 Choix de la méthode d’analyse : électrophorèse 1D ou 2D ?
3.1.1.2 Choix du substrat témoin
3.1.1.3 Marquage métabolique au35S
3.1.2 Identification des protéines en LC-MS/MS
3.1.3 Une analyse quantitative des protéines membranaires
3.1.3.1 Protein Abundance Index
3.1.3.2 Spectral count
3.2 Article 3
3.2.1 Complément d’analyse de la fraction de protéines membranaires
3.2.2 Limites de la méthode
3.3 La découverte de P450 alcane monooxygénase de type CYP153 chez la souche IFP 2173
4 Étape initiale de dégradation du 2-EHN
4.1 Les alcane hydroxylases de type alkB3
4.1.1 Le gène alkB1
4.1.2 Le gène alkB2
4.1.3 Clonage et expression chez Escherichia coli
4.1.3.1 Stratégie de clonage
4.1.3.2 Surproduction de AlkB1 dans E. coli
4.1.4 Clonage et expression chez Mycobacterium smegmatis mc²155
4.1.4.1 Stratégie de clonage
4.1.4.2 Tests d’induction de AlkB chez M. smegmatis mc²155
4.1.4.3 Test de dégradation du 2-EHN
4.2 Le cytochrome P450 de type CYP153
4.2.1 Mise en évidence
4.2.2 Clonage et expression du cyp153-1 chez E. coli
4.2.3 Test d’expression chez M. smegmatis mc²4517
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 
1 Biodégradabilité du 2-EHN
2 Voie de dégradation du 2-EHN par M. austroafricanum IFP 2173
3 Recherche des enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN
4 Existence de multiples alcane hydroxylases dans la souche IFP 2173
5 AlkB ou CYP153 ?
6 Expression et Clonage des alcanes hydroxylases
7 Perspectives
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES