Définition de la culture in vitro 

Mutation spontanée

Des mutations se produisent spontanément dans tout ce qui vit (SIGURBJÖRNSSON, 1964). La mutation spontanée peut être due à des actions des facteurs endogènes ou facteurs intracellulaires ou des actions des facteurs exogènes de la cellule (VAN HARTEN, 1998). Cette évolution correspond à la notion biologique d’adaptation dans un écosystème (http://6). La proportion des mutations spontanées est très faible. Elle est de l‟ordre de 1/10 000 jeunes plantes. Mutation induite MULLER (1927) pensait que les mutations induites pourraient révolutionner la sélection des plantes. C‟est une mutation provoquée par l‟intervention humaine en utilisant des agents mutagènes. Elle permet d‟augmenter la variabilité génétique au sein des espèces végétales et vise à réorganiser la composition génétique des plantes pour développer les caractères de tolérance ou de résistance aux maladies ou aux facteurs climatiques ou autres caractères (RAZAFINIRINA, 2011). La dose d‟irradiation à appliquer dépend du type d‟explant à irradier : cals, graines, racines, tiges feuilles, … (IAEA, 1995 ; RAZAFINIRINA, 2011).
La figure 2 suivante montre l‟évolution de la production de la variété mutante issue de différentes plantes. Dans la base IAEA (figure2), en Décembre 2000, 2252 de variétés mutantes ont été comptées, et en septembre 2012, 3220 variétés ont été recensées dont (http://7) :
 Plantes ornementales diverses : 719 (22,1%) dont chrysanthème 288 et rose 86
 Plantes agricoles : 2501 (77,9%) dont riz 816, orge 309, blé 285, soja 170, maïs 100, arachide 72 et coton 46.

Avantage des mutations

Un des grands avantages des mutations induites est qu’elles permettent aux sélectionneurs d’apporter des améliorations spécifiques sans nuire aux caractéristiques favorables des plantes.
L‟induction de mutation par des agents mutagènes physiques ou chimiques raccourcit le temps d‟obtention d‟une nouvelle lignée à caractère intéressant en 4 ou 5 ans, par rapport à la méthode conventionnelle qui nécessite 10 à 12 ans (FAO/IAEA, 1991, SOAFANOMEZANTSARA, 2011).
A titre de comparaison, une nouvelle variété de riz connue sous le sigle IR-8, a été produite par l’Institut international de recherches sur le riz (IRRI). Elle présente une augmentation considérable du rendement (FAO/IAEA, 1995).
Les mutations ont joué aussi des rôles importants dans différentes domaines de la recherche biologique dont l‟amélioration des plantes comme : la précocité, la meilleure productivité, la résistance aux maladies, la résistance à la salinité ou au froid (IAEA, 1995 ; ANDRIANJAKA, 2011).

Inconvénients

Les mutations naturelles ou spontanées ont un certain nombre de causes. Les rayons cosmiques qui frappent constamment la terre peuvent pénétrer facilement dans la matière. Si l’un d’entre eux atteint un chromosome, il peut provoquer une modification ou mutation (SIGURBJÖRNSSON, 1964).
Certaines plantes mutées sont stériles et ne donnent pas de descendance, et d‟autres sont récessives (SANGWAN, 1975).

MATERIEL VEGETAL

Présentation de l’espèce

Les graines de riz de la variété B22 et F154 irradiées ou non irradiées issues de la 2 ème génération (M2) ont été utilisées comme matériel végétal dans ce travail (photo1).
D‟après le résultat sur le test de sensibilité à l‟irradiation sur les variétés de riz B22, F154 et Jean Louis effectué par RAZAFINIRINA (2011), les parents de ces variétés ont été irradiés par le rayon gamma (γ) en utilisant le Cobalt 60 (60Co) comme source de radiation. Cet agent mutagène physique a été choisi car c‟est le plus utilisé en amélio ration des plantes, à cause de ses caractéristiques dont « longueur d‟onde la plus courte, (inférieure à 1 Angström), radiation très pénétrante et à niveau d‟énergie élevé supérieur à 10 Mev » (IAEA, 1977 ; IAEA, 1995 ; VAN HARTEN, 1998 ; RAKOTOARISOA, 2008.).
Les doses suivantes ont été appliquées à 0 Gy, 100 Gy, 200 Gy et 300 Gy pour la variété B22 et 0 Gy, 100 Gy et 200 Gy pour la variété F154. Cinq graines par boîte de Pétri avec dix répétition par dose, par milieu de culture et par variété ont été utilisées à chaque manipulation (photo3).

Stérilisation des milieux de culture

Les milieux doivent être préparés avec prudence pour ne pas dépasser ni diminuer la dose des compositions chimiques (photos 7). La composition de ces produits est versée une à une par ordre dans la liste pour éviter toute sortes de précipitation qui pourraient se produire lors de la manipulation dans l‟Erlen-Meyer ou flacon (photos 7) contenant de l‟eau distillée stérile et déminéralisée.
Ensuite, le phytagel ou l’agar est versé dans le mélange, puis agité pendant quelques minutes. Enfin, le pH du milieu est ajusté à 5,6 à 5,8. Les différents milieux de culture ont été stérilisés dans l’autoclave pendant 20 minutes à 1,5 bar, puis coulés dans des boîtes de Pétri et des tubes à essais à raison de 15ml environ, toujours sous hotte à flux laminaire.

Stérilisation des graines

Déglumage des graines

Les graines de riz ont été deglumées manuellement et soigneusement pour ne pas détruire l’embryon.

Désinfection des graines sous hotte à flux laminaire

La désinfection s‟effectue en plusieurs étapes :
D‟abord, les graines ont été trempées dans une boîte de Pétri contenant de la solution de desinfectol (alcool 70%), l’ensemble est remuée énergiquement pendant quelques minutes (5 min). Ensuite, elles sont trempées dans la solution d’hypochlorite de calcium (Ca(OCl) 2) 20% et additionnées de 3 gouttes de tween pendant 20 mn tout en agitant toutes les 5 mn. Elles sont rincées avec de l‟eau distillée stérile plusieurs fois pour enlever les restes des produits et jetées. Ensuite, les graines ont été trempées dans la solution de formol (0,8%) pendant 40 mn.
L‟ensemble a été bien remué, puis la solution a été jetée. A la fin, les graines ont été rincées quatre à cinq fois avec de l’eau distillée stérile.

Culture in vitro d’embryons matures de riz pour l’induction de cals (soushotte à flux laminaire)

Apres la désinfection, les embryons ont été prélevés stérilement à l‟aide d‟une paire de pince et scalpel stérile, sous loupe binoculaire (photo 8), puis la face scutellaire (la partie farineuse) a été placée vers le haut, dans des boîtes de Pétri (10 cm de diamètre) contenant le milieu de callogenèse (RAKOTOARISOA, 2010).

Suivi et entretien

Les boîtes de Pétri contaminées ont été retirées systématiquement. Elles se reconnaissent facilement par l‟apparition des taches blanches, jaunes ou noires sur la surface du milieu de culture, il peut être toutefois des champignons, des bactéries ou des virus. Ces contaminations sont dues à une mauvaise manipulation ou à des outils mal stérilisés.

Régénération in vitro des plantules

Méthodes de culture utilisées pour la régénération de plantules

Pour la régénération directe, le milieu de base MS (5519)/2 a été utilisé pour l‟embryogenèse directe. Les graines de la 2 ème génération (M2) ont été cultivées sur MS/2 et les plantules obtenues ont été divisées par talle . Chaque talle est régénérée et nommée par génération. La multiplication se fait à partir de M2V1 jusqu‟à l‟obtention de M2V4. Cette dernière fera l‟objet de la sélection dans les conditions contrôlées ultérieure s.
Pour la régénération indirecte : Les cals obtenus par culture d’embryons ont été transférés dans des milieux de régénération MS (6899) et LS (127) (tableaux 4 et 5).
Les tubes bien scellés sont soumis à une photopériode de 16 heures /8 (16 heures de luminosité et 8 heures d‟obscurité) avec intensité lumineuse fluorescente 3500 à 4000 lux.
L‟ensemble est gardé dans la chambre de culture à 252 °C (photos 9) jusqu‟à l‟obtention de plantules de taille supérieur à 1cm.
La photos 9 suivante montre les cultures placées dans la chambre de croissance.

Effectifs de cals obtenus après multiplication

Les effectifs des cals obtenus après chaque multiplication par boîte de Pétri sont représentés sous forme de courbe de densité (figure 3). La valeur la plus fréquente correspond à une densité élevée et vice-versa pour la valeur moins fréquente. En général, les effectifs des cals le plus répété pour tous les génotypes varie nt de 10 à 20. Les variétés parents B22-0Gy et F154-0Gy ont une densité élevé de 0.08 qui correspond au nombre d‟effectif 10, leur effectif minimal est de 0 et le maximal est de 20. Le nombre de cals des autres variétés varie de 12 à 23. Certains génotypes comme B22-200Gy et F154-100Gy possèdent des effectifs jusqu‟à 28.

Taux de plantules régénérées par embryogenèse directe

Le taux de plantules obtenus par embryogenèse directe est présenté par le tableau 9.
Le résultat montre que toutes les variétés germent dans le milieu MS (5519)/2 (tableau 10).
Les variétés irradiées ont un pourcentage plus de 50% par contre les variétés parent es B220Gy et F154 0Gy n‟ont que 30% (tableau 10). Ces résultats expliquent que l‟irradiation favorise la régénération directe des plantules issues de l‟embryon pour les deux variétés dans le milieu MS (5519)/2.
Les génotypes irradiés B22 200Gy et F154 100Gy présentent des pourcentages (64%) supérieur par rapport aux autres génotypes (tableau 10).

Pour l’induction des cals

La première observation dans l‟induction de cals est la sortie de l‟épicotyle pour toutes les variétés quel que soit le milieu de culture utilisé. Cette étape marque le début de la germination en physiologie. Après deux semaines de culture, les différenciations des cals en cals embryogènes ou non apparaissent, ce résultat est conforme à celui observé par RAKOTOARISOA (2000). C‟est dans ce stade de différenciation que la composition du milieu de base comme le macroélément, le microélément ainsi que les vitamines et les différentes régulateurs de croissance ou hormones comme: le 2,4-D, le BAP et le NAA ainsi que les pH démontrent leur importance selon leurs concentrations surtout pendant le stade de l‟induction de cals et ensuite dans le processus de développement, hypothèse identique à celle de RAJAONARITININA (2006).
En effet, les quantités de ces hormones et des éléments chimiques jouent des rôles importants sur la différenciation définitive des explants cultivés.
Dans notre étude, une concentration hormonale de 2mg/l de 2,4-D, favorise la production de cellules non indifférenciés ou cals avec les milieux MS (6899) et LS (127). Nos résultats confirment le rapport entre les hormones qui ont été trouvés par NOVELLO en 2005 sur le processus de développement d‟une cellule, de tissu ou d‟organe (figure 7). L‟hormone appelée auxine à forte dose permet la rhizogenèse. La cytokinine à forte dose permet le bourgeonnement. Les rôles sont définis dans la figure 7 ci-après.

Pour la régénération

Il existe deux voies d‟embryogenèse :
 L‟embryogenèse directe
Cette première voie dépend en général de la quantité des compositions du milieu de base utilisé pour la culture. Dans cette étude, l‟utilisation du milieu de base MS (5519) demi ou MS (5519)/2 permet d‟obtenir des bourgeons néoformés et qui se différencient par la suite en plantules, sans toucher aux compositions chimiques de l‟hormone BAP 2 mg/l, 8g/l d‟agar,15g/l de sucrose et le pH a été ajusté à 5.7.
 L‟embryogenèse indirecte ou embryogenèse via cals.
Les cals obtenues sont transférés dans les milieux de régénérations LS (127) et MS (6899).
Ces substrats sont dépourvus d‟hormones 2, 4-D équivalents à l‟hormone auxine dont son rôle est la prolifération cellulaire. La présence des hormones comme le BAP équivalent à l‟hormone naturelle cytokinine qui favorise l‟élongation cellulaire, conduit à la régénération des plantules. L‟évolution des embryons somatiques suit le même processus de développement morphologique que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir : stade globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire dont ceux-ci ne sont pas visibles qu‟à partir du stade globulaire, cordiforme et torpille qui entre dans la phase mature (Photos 14), conforme à celui observé par EGERTSDOTTER et ARNOLD (1998).
Les plantes ont bien poussé dans les trois milieux de cultures solides mais les quantités de plantules obtenues sur les sept génotypes diffèrent les uns aux autres. D‟après l‟analyse statistique (Annexe 3), les milieux de régénérations LS (127) et MS (6899) ne présentent pas de différence significative pour la production des plantules, or la composition chimique du milieu de base est différente. Ce qui permet de dire que les plantes exigent une norme sur la composition du milieu de base. Les deux milieux de régénération ont donné le même résultat par la production et le développement de plantules mais de taux différents. Les variétés F154 ont une performance dans le milieu d‟induction de cals LS (127) et donne de s quantités favorables sur la régénération des plantules utilisant le même milieu de base mais à composition hormonale différente (BAP à 2mg/l). Par contre les variétés B22 sont avantageux dans le milieu d‟induction MS (6899) similaire aux résultats obtenus par RAKOTOARISOA (2008) « milieu de base MS (composition organique et inorganique) décrit par Murashige et Skoog (1962), avec 2mg/l de 2,4-D ; 0.5mg/l Kinétine ; 30g/l de sucrose et 5.5g/l d‟agaroseest favorable pour la variété B22 »
Dans cette étude, nous avons constaté que l‟irradiation présente un effet favorable que ce soit sur l‟induction de cals ou sur la régénération de plantes de ces deux variétés. Ce résultat confirme celui observé par RAZAFINIRINA en 2011.
Le test de Tukey nous a conduits à comparer les trois milieux de régénération ( figure 6)
 la première, regroupant les milieux LS (127) et MS (6899) pourvus de 2,4 -D, de BAP et du NAA, macroélément et microéléments qui ont permis d‟obtenir un bon rendement sur les variétés B22 et F154.
 la seconde représente MS (5519)/2, dont les moyennes de résultats varient de 3 à 7 qui sont assez faibles par rapport aux milieux de la régénération indirecte.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVE

Dans la présente étude, l‟objectif de régénérer des plantules via embryogenèse somatique est atteint. Les résultats de cette étude nous ont permis de confirmer que la régénération in vitro de l‟espèce Oryza sativa via l‟embryogenèse somatique est possible sur les variétés B22 et F154 irradiées.
Le nombre de cals embryogènes produit dépend du milieu d‟induction et du génotype de la plante. La variété B22 préfère le milieu MS (6899) dans les différentes doses d‟irradiation 0Gy, 100Gy, 200Gy et 300Gy, il s‟agit respectivement de 52, 66, 85 et 70 alors que la variété F154 se développe mieux en milieu LS (127) dans toutes les dose d‟irradiation 0Gy, 100Gy, 200Gy, il s‟agit respectivement de 56, 89 et 73.
Le nombre de plantules produit dans le milieu MS (5519)/2 pour les deux variétés B22 et F154 est identique à la dose d‟irradiation 0Gy, il est de 12 ; pour la dose 100 Gy, ce taux est respectivement 21, 24 et à la dose 200Gy, 26 et 19. L‟irradiation apporte un effet favorable que ce soit pour l‟induction de cals que pour la régénération de plantules.
La dose d‟irradiation 200Gy est meilleure pour apporter une réponse élevée pour la variété B22 avec un nombre de 85 pour l‟induction de cals et 41 pour la régénération. C‟est la dose 100Gy pour F154 dont le nombre des cals induits est de 89 et celle de la régénération est de 32. Ce sont les doses optimales pour produire des cals et de plantules. La production a diminué progressivement en dehors de ces doses. L‟aptitude à la régénération n‟est pas limitée uniquement sur la qualité du milieu de base mais elle dépend aussi de la qualité des cals (embryogènes ou non) et surtout du génotype de la variété.
L‟embryogenèse somatique permet donc en un temps très court (six semaines dans notre expérience) de produire des plantes entières sans passer par les contraintes.
Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in-vitro, l’embryogenèse somatique se montre plus séduisante en termes de performance et d’efficacité. En effet, la maîtrise de la production d’embryons, chez certaines espèces, via les suspensions cellulaires a permis d’obtenir des milliers d’embryons par litre de milieu de culture et par conséquent la régénération de milliers de plants.
La production de plantules par cette étude permettra l‟obtention de lignées de riz après sélection in vitro et en serre. Ces plantules régénérées feront l‟objet de la sélection ultérieure de lignées tolérantes à Striga asiatica. Elle contribuerait à l‟augmentation de la production de riz au pays et pourrait également contribuer à la réduction de l‟insécurité alimentaire à Madagascar.
Nous envisagerons dans nos prochaines études d‟évaluer la qualité nutritionnelle des lignées de riz sélectionnées issues de l‟embryogenèse somatique, d‟effectuer une analyse moléculaire de ces variétés performantes, pour compléter les données sur les caractères apparus, avant de vulgariser les semences aux paysans et aux consommateurs.

Table des matières

Remerciement 
Table de matière
Liste des figures 
Liste des photos
Liste des tableaux
Abréviations
Glossaire
Liste des annexes
INTRODUCTION
Chapitre I GENERALITES
I.1 LE RIZ
I.1.1 Biologie du riz
I.1.2 Morphologie du riz
I.1.3 Taxonomie
I.2 CULTURE IN VITRO
I.2.1 Historique
I.2.2 Définition de la culture in vitro
I.2.3 Différentes techniques utilisées en culture in vitro
I.3 EMBRYOGENESE SOMATIQUE
I.3.1 Principe
I.3.2 Explant utilisé
I.3.3 Caractéristiques des cellules embryogènes
I.3.4 Méthode
I.3.5 Avantage de l‟embryogenèse somatique
I.3.6 Inconvénients
I.4 MUTAGENESE
I.4.1 Historique
I.4.2 Définition de mutation
I.4.3 Origines de la mutation
I.4.4 Les types d‟agents mutagènes
I.4.5 Avantage des mutations
I.4.6 Inconvénients
Chapitre II MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIEL VEGETAL
II.1.1 Présentation de l’espèce
II.1.2 Source parentale
II.2 MATERIELS DE LABORATOIRE
II.3 PROTOCOLE EXPERIMENTAL
II.3.1 Condition obligatoire pour la culture in vitro
II.3.2 Préparation des milieux de culture
II.3.3 Stérilisation des milieux de culture
II.3.4 Stérilisation des graines
II.3.5 Suivi et entretien
II.3.6 Régénération in vitro des plantules
II.3.7 Méthode de calcul
II.3.8 Analyse statistique
Chapitre III RESULTATS
III.1 L’INDUCTION DE CALS
III.1.1 L‟effet du milieu sur les génotypes
III.1.2 Induction des cals
III.2 REGENERATION DE PLANTULES
III.2.1 Régénération directe par embryogenèse directe
Régénération indirecte par induction de cals
Chapitre IV DISCUSSIONS
IV.1 Pour l’induction des cals
IV.2 Pour la régénération
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 
BIBLIOGRAPHIQUE