Cultures des microorganismes

Dans cette section nous décrirons les milieuxd utilisés ainsi que les conditions de culture pour les différentes souches. 

Milieux et conditions de culture

Sphaerotilus natans  Milieux de culture

Pour la culture de cette souche, nous avons utilisé 2 milieux différents : CGYA : C’est le milieu de référence décrit par l’ATCC (1992) pour la culture des différentes souches de Sphaerotilus natans. Ce milieu se présente à l’origine sous forme de bouillon dont la composition est la suivante : d Tous les milieux sont autoclavés 15 minutes à 120°C avant d’être utilisés pour la culture des microorganismes. Chapitre II : Matériels et Méthodes 89 • Casitone…………………………….……5 g.L-1 • Glycérol………………………………….10 g.L-1 • Extrait de levure………………………….1 g.L-1 Une gélose dérivée du bouillon a été produite en ajoutant de l’agar à raison de 1,25% (m/v). NB (Nutrient Broth) : ce milieu a été utilisé pour la culture de Sphaerotilus natans par Suzuki et al. (2002). C’est un milieu lyophilisé prêt à l’emploi que l’on utilise d’ordinaire à une concentration de 0,8 % (8 g de milieu lyophilisé pour 1 litre d’eau). On peut aisément faire varier sa concentration et ainsi induire la croissance du microorganisme sous forme monocellulaire ou de filament. Composition de milieu : • Extraits de viande…………………………3 g.L-1 • Peptones………………………………….5 g.L-1 Il est également possible d’obtenir une gélose dérivée de ce milieu en ajoutant de l’agar à une concentration de 1,25 % (m/v). Au cours de ces travaux, le milieu NB a été utilisé à des concentrations de 0,05 ; 0,1 ; 0,5 et 1%.  Conditions de culture Avec les milieux CGYA et NB, les cultures ont été réalisées en étuve à 30°C, sous agitation et dans des Erlenmeyer à triple baffles. Ils sont fermés à l’aide de bouchons en cellulose autoclavés, laissant uniquement passer l’air. Avec les géloses dérivées des milieux CGY et NB, la culture est également réalisée en étuve à 30°C. 

Leptothrix

  Milieux de culture

Pour les 2 souches de Leptothrix, un milieu liquide (1503) et un milieu solide (803) ont été utilisés. Milieu 1503 : ce bouillon a été décrit par l’ATCC pour la culture de Leptothrix. Composition du milieu : • Peptone……………………………….0,5 g.L-1 • Extraits de levure………………………0,5 g.L-1 • Glucose……………………………….0,5 g.L-1 • MgSO4·7H2O…………………….….0,6 g.L-1 • CaCl2·2H2O…………………………..0,07 g.L-1 • HEPES………………………………..3,57 g.L-1 • MnSO4………………………………17 mg.L-1 Le pH final doit être ajusté à 7,3. Milieu 803 : ce milieu a été défini par le DSMZ comme étant destiné à la culture de Leptothrix et Sphaerotilus. Composition du milieu : • Extraits de levure……………….………1 g.L-1 • Peptones……………………………….1,5 g.L-1 • MgSO4·7H2O…………………………0,2 g.L-1 • CaCl2…………………………………..0,05 g.L-1 • Citrate d’ammonium ferrique…………….0,5 g.L-1 • MnSO4·H2O……………………………0,05 g.L-1 • FeCl3·6H2O……………………………0,01 g.L-1 • Agar…………………………………..20 g.L-1 Le pH final est ajusté à 7,1. Chapitre II : Matériels et Méthodes 91  Conditions de culture : Les conditions de cultures sont identiques à celles de Sphaerotilus natans. 1.2.1.3 Lactobacillus delbruekii  Milieu de culture : Le milieu MRS a été employé pour la culture de Lactobacillus delbruekii. Ce milieu lyophilisé est prêt à l’emploi. Composition du milieu MRS : • Peptone de viande………………….……..10 g.L-1 • Extraits de viande……………………..…..8 g.L-1 • Extraits de levure………………………….4 g.L-1 • Acétate de sodium…………………………5 g.L-1 • Hydrogénophosphate de potassium…………2 g.L-1 • Citrate d’ammonium……………………….2 g.L-1 • Sulfate de magnésium……………..……..0.2 g.L-1 • Sulfate de manganèse……….…………..0.05 g.L-1 • Glucose……………………………….….20 g.L-1 • Tween 80………………..…………………1mL  Conditions de culture : La culture est réalisée en fermenteur à 42°C et sous agitation.

Saccharomyces cerevisiae 

Milieu de culture : Le milieu de Sabouraud est utilisé pour la culture de ce microorganisme. Ce milieu contenant principalement de la peptone de viande (7 g.L-1) et du glucose (20 g.L-1) 1 se présente sous la forme lyophilisée. Chapitre II : Matériels et Méthodes 92 La préparation d’un litre de milieu nécessite l’utilisation de 60 g de lyophilisat et, dans notre cas, 130 g de glucose ont été ajoutés pour obtenir une concentration finale de 150 g.L-1 .  Conditions de culture : La culture est réalisée en milieu de Sabouraud à 28°C et sous agitation.

Culture en Bioréacteurs

Pour une partie de nos travaux, des cultures en bioréacteurs ont dû être réalisées. Ces cultures sont de type Batch, c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’apport de substrat au cours de la culture. La croissance des microorganismes s’arrête donc lorsque le substrat est épuisé. Elles ont été faites au sein du laboratoire de Microbiologie Industriels du Pr. BOUIX à l’ENSIA/AgroParisTech Massy. Ces cultures ont été réalisées avec les souches Sphaerotilus natans 15291 et 29330, Lactobacillus delbruekii et Saccharomyces cerevisiae. 

Les fermenteurs

Les fermenteurs Set 2M (Inceltech) d’une capacité de 2 L, sont remplis avec 1,6 L du milieu approprié pour la culture de chaque souche. Ils sont ensuite autoclavés à 120°C pendant 20 minutes. Au cours de la culture, la température est régulée, le pH est mesuré et dans certains cas régulé, et le milieu maintenu sous agitation constante (cf. Figure 22). Figure 22 : Fermenteurs utilisés lors des travaux. A) fermenteurs de 2L à fond arrondi et agitation par une hélice située juste au dessus du diffuseur d’air. B) fermenteurs cylindriques à fond plat et à agitation par une hélice située tout en bas du réacteur et au dessous du diffuseur d’air.

Les conditions de culture des différentes souches 

Sphaerotilus natans : Les fermenteurs sont remplis avec 1,6 L de milieu CGYA. La température est régulée à 30°C. Le pH est mesuré tout au long de la culture mais n’est pas régulé. Étant donné qu’il s’agit de bactéries aérobies, un apport d’air est également fourni. La culture est agitée à une vitesse de 300 rpm afin de maintenir les microorganismes en suspension. L’inoculum utilisé pour ensemencer le réacteur est issu d’une culture fraîche, âgée de 16 heures en milieu CGYA à 30°C.  Lactobacillus Delbruekii : Les fermenteurs sont remplis avec 1,6 L de milieu MRS. La température est régulée à 42°C. Le pH est mesuré tout au long du suivi mais n’est pas régulé. La culture est agitée par une hélice à 140 rpm. La culture est réalisée en conditions fermentatives. L’inoculum utilisé pour ensemencer le réacteur est issu d’une culture fraîche, âgée de 16 heures en milieu MRS à 42°C.  Saccharomyces cerevisiae : Les fermenteurs sont remplis avec 1,6L de milieu de Sabouraud à une concentration finale en glucose de 150 g.L-1. Le pH est régulé à 4,0 grâce à du NaOH 2N au cours du suivi. La température est régulée à 28°C et le milieu est maintenu sous agitation constante (140 rpm). L’inoculum utilisé pour ensemencer le réacteur est issu d’une culture fraîche, âgée de 16 heures en milieu de Sabouraud à 28°C.