LLAIL-CLIC1000
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MATERIEL ET METHODES
Matériel biologique
Déroulement et population étudiée
Notre étude a été réalisée sur 60 individus de sexe masculin âgés de 35 à 40 ans, dont 40 ont subi un traumatisme physique lié à un violent accident de la circulation.
Ils sont sélectionnés au moment de leur prise en charge par le personnel médical des urgences du CHU (centre hospitalo-universitaire) et sont comparés à une population témoin de 20 individus (hommes).
Lieu et durée de l’expérimentation :
L’expérimentation a été réalisée au niveau de l’unité des urgences (déchoquage et réanimation) du CHU Ibn Rochd d’Annaba.
Le recrutement du plus grand nombre de patients s’est réalisé durant l’été 2011 (Juin-Août), période connue pour son fort taux d’accidents de la circulation.
Lots expérimentaux :
Les patients sélectionnés pour notre étude ont été répartis suite au traumatisme plus ou moins violent à caractère destructeur lié à l’accident de la route, selon la gravité des blessures, et après avis médical, en 2 lots expérimentaux de 20 individus chacun, comparés à un lot témoin de 20 hommes.
Lot (T) témoin : À l’aide du test de Lafleur J et Béliveau R (santé mentale Canada), nous avons évalué le niveau de stress d’une vingtaine d’hommes qui se sont portés volontaires pour l’expérimentation. Cette évaluation a été réalisée deux mois avant le début de l’expérimentation puis au moment de l’expérimentation. Nous avons comparé les résultats de ces individus pour les deux tests et conclu selon les directives de santé mentale Canada qu’ils sont dotés d’un équilibre psychique, et n’ont subi aucun traumatisme durant l’année qui précède le début de notre expérimentation.
Lot V1 (victimes1) : Les hommes de ce lot ne considèrent pas avoir été en danger réel malgré qu’ils aient subi un traumatisme physique (accident de la circulation), mais nécessitant un transfert vers la structure d’urgences, vu leurs légères blessures.
Lot V2 (victimes2): Les hommes de ce lot ont subi un traumatisme physique (accident de la circulation), avec de graves blessures qui ont nécessité un transfert immédiat vers les services d’urgences.
Prélèvement sanguin :
Le prélèvement du sang veineux est réalisé à l’admission du patient au service des urgences du CHU Ibn Rochd d’Annaba. Le prélèvement sanguin se fait au niveau du pli du coude, sauf pour certains cas. Le sang est collecté dans des tubes à EDTA.
Après centrifugation immédiate pendant 20 minutes à 3500 tr/min, le plasma aliquoté, dans des tubes Eppendorf, est congelé à -14°C. Il servira aux dosages du glucose, cholestérol, triglycérides, cortisol, TSH, T3, T4 testostérone, IgG et IgM .
Méthodes :
Les différents dosages (biochimiques, hormonaux, immunitaires) ont été réalisés au niveau d’un laboratoire d’analyses médicales privé, Annaba.
Dosage des paramètres biochimiques :
Dosage du glucose plasmatique :
Le dosage du glucose a été réalisé selon la technique de Trinder P (1969).
Principe :
En présence de la glucose-oxydase (G.O.D.), le glucose est oxydé en acide gluconique. L’eau oxygénée H2O2 libérée au cours de la réaction réagit sous l’action de la peroxydase (P.O.D.) avec le phénol et l’amino-4-phénazone, pour former un complexe rose. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en glucose.
Dosage du cholestérol par la méthode de la cholestérol-oxydase :
Principe :
D’après la technique enzymo-colorimétrique de Thomas L (1992), le cholestérol et ses esters sont libérés à partir des lipoprotéines par des détergents.
Dosage des triglycérides par la méthode de la glycérol-oxydase :
Principe :
Selon la détermination enzymatique de Jacobs N, Van Denmark P.J(1975), les triglycérides sont enzymatiquement hydrolysés en glycérol et en acides gras libres.
Le glycérol, sous l’effet de la glycérol-kinase et de la glycérol – 3- phosphate oxydase, forme H2O2.
Dosages des paramètres immunitaires IgG /IgM :
Le dosage, effectué grâce à un kit de dosage spécifique aux immunoglobulines et contenant des anti-sérums anti IgG et IgM, permet de quantifier les IgG et les IgM, qui sont des marqueurs immunologiques humains de la réponse immunitaire (Bläker F, 1984).
Principe :
Les immunoglobulines contenues dans le sérum humain forment avec les anticorps spécifiques, des immunocomplexes sur lesquels est envoyée une lumière. L’intensité de la lumière dispersée est fonction de la concentration dans l’échantillon, de l’immunoglobuline recherchée. L’exploitation se fait par rapport à un standard connu.
Méthode : Toutes les étapes du dosage sont effectuées automatiquement
Mesure des échantillons des patients :
Les échantillons des patients sont dilués automatiquement au 1/20 ou au 1/400 (IgG), avec le N diluant, puis mesurés. Si les valeurs sont supérieures au domaine de mesure, la mesure peut être répétée automatiquement avec une dilution plus élevée de l’échantillon.
Dosage des paramètres hormonaux :
Dosage du cortisol plasmatique :
Le dosage du cortisol plasmatique a été effectué par le test d’électro-chimiluminescence (E.C.L.I.A.) qui est adapté aux dosages immunologiques sur les analyseurs Elecsys 1010 (Aaron DC et Tyrrell JB, 1994). Ce test immunologique permet la détermination quantitative in vitro du cortisol dans le sérum et le plasma humain.
Le test immunologique est basé sur la méthode « sandwich » qui utilise deux anticorps monoclonaux spécifiques du cortisol. Le premier, biotinylé, reconnaît l’extrémité N-terminale du cortisol, et le second, marqué au ruthénium, réagit avec la partie médiane de la molécule.
Etapes du dosage :
– 1ère incubation : une prise d’essai de 20 µl est mise en présence de l’anticorps anticortisol marquée à la biotine et de l’anticorps marqué au ruthénium. Il se forme un « sandwich » entre l’hormone et les deux anticorps.
– 2ème incubation: les microparticules tapissées de streptavidine sont ajustées dans la cuvette réactionnelle. Le complexe immunologique est fixé à la phase solide par une liaison streptavidine-biotine.
Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant.
L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage dans une solution de lavage. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production d’une luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de référence mémorisée. Le réajustement de la courbe par l’appareil est effectué à l’aide de 2 solutions de cortisol Cal Set.
Dosage de la T.S.H. :
Le dosage de la T.S.H. plasmatique a été effectué par le test d’électro- chimiluminescence (E.C.L.I.A.), qui est adapté aux dosages immunologiques sur les analyseurs Elecsys 1010 (Wheeler MH et Lazarus JH, 1994). Ce test immunologique permet la détermination quantitative in-vitro de la T.S.H. dans le sérum et le plasma humain.
Le test immunologique est basé sur la méthode « sandwich », qui utilise deux anticorps monoclonaux spécifiques à la TSH. Le premier, biotinylé, reconnaît l’extrémité N- terminale de la TSH et le second, marqué au ruthénium, réagit avec la partie médiane de la molécule.
Etapes du dosage :
– 1ère Incubation : une prise d’essai de 20 µl est mise en présence de l’anticorps anti TSH marqué à la biotine et de l’anticorps marqué au ruthénium. Il se forme un « sandwich » entre l’hormone et les 2 anticorps.
– 2ème incubation : les microparticules tapissées de streptavidine sont ajustées dans la cuvette réactionnelle. Le complexe immunologique est fixé à la phase solide par une liaison streptavidine-biotine.
Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant.
L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage dans une solution de lavage.
Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production d’une luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de référence mémorisée. Le réajustement de la courbe par l’appareil est effectué à l’aide de 2 solutions de T.S.H. Cal Set.
Dosage de la T4 :
Le dosage de la T4 plasmatique a été effectué par le test d’électro- chimi-luminescence (E.C.L.I.A.), qui est adapté aux dosages immunologiques sur les analyseurs Elecsys 1010 (Wheeler MH et Lazarus JH, 1994). Ce test immunologique permet la détermination quantitative in-vitro de la T4 dans le sérum et le plasma humain.
Le test immunologique est basé sur le principe de la compétition utilisant des anticorps spécifiques dirigés contre la T4. La T4 endogène, libérée par l’action de l’acide 8 –amillino-1-naphtalène sulfonique (A.N.S.), entre en compétition, pour les sites de fixation des anticorps, anti-T4 marqués au ruthénium, avec la T4 exogène ajoutée lors de la première incubation.
Etapes du dosage :
– 1ère Incubation : une prise d’essai de 15 µl est mise en présence de T4 marquée au ruthénium et d’A.N.S. La T4 liée aux protéines porteuses est libérée par l’action de l’A.N.S.
– 2ème incubation : les microparticules tapissées de streptavidine sont ajustées dans la cuvette réactionnelle, ainsi que les anticorps anti-T4 marqués à la biotine.
La T4 endogène et la T4 biotinylée exogène entrent compétition vis-à-vis des anticorps.
Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant.
L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage dans une solution de lavage.
Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production d’une luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de référence mémorisée. Le réajustement de la courbe par l’appareil est effectué à l’aide de 2 solutions de T4 Cal Set.
Dosage de la T3 :
Le dosage de la T3 plasmatique a été effectué par le test d’électro- chimi-luminescence (E.C.L.I.A.), qui est adapté aux dosages immunologiques sur les analyseurs Elecsys 1010 (Wheeler MH et Lazarus JH, 1994). Ce test immunologique permet la détermination quantitative in-vitro de la T3 dans le sérum et le plasma humain.
Table des matières
1 – INTRODUCTION
2 – MATERIEL ET METHODES
2-1 – Matériel biologique
2-1-1 – Déroulement et population étudiée
2-1-2 – Lieu et durée de l’expérimentation
2-1-3 – Lots expérimentaux
2-1-4 – Prélèvement sanguin
2-1-5 – Protocole expérimental
2-2 – Méthodes
2-2-1 – Dosage des paramètres biochimiques
2-2-1-1 – Dosage du glucose plasmatique
2-2-1-1-1 – Principe
2-2-1-1-2 – Mode opératoire
2-2-1-2 – Dosage du cholestérol par la méthode de la cholestérol-oxydase
2-2-1-2-1 – Principe
2-2-1-2-2 – Mode opératoire
2-2-1-3 – Dosage des triglycérides par la méthode de la glycérol-oxydase
2-2-1-3-1 – Principe
2-2-1-3-2 – Mode opératoire
2-2-1-3-3 – Calcul de la concentration
2-2-2 – Dosages des paramètres immunitaires
2-2-2-1 – Principe
2-2-2-2 – Mesure des échantillons des patients
2-2-3 – Dosage des paramètres hormonaux
2-2-3-1 – Dosage du cortisol plasmatique
2-2-3-1-1 – Principe
2-2-3-1-2 – Etapes du dosage
2-2-3-2 – Dosage de la T
2-2-3-2-1 – Principe
2-2-3-2-2- Etapes du dosage
2-2-3-3 – Dosage de la T4
2-2-3-3-1 – Principe
2-2-3-3-2 – Etapes du dosage
2-2-3-4 – Dosage de la T3
2-2-3-4-1 – Principe
2-2-3-4-2 – Etapes du dosage
2-2-3-5 – Dosage de la testostérone plasmatique
2-2-3-5-1 – Principe
2-2-3-5-2 – Etapes du dosage
2-2-4 – Méthodes d’analyses statistiques
2-2-4-1 – Description des données
2-2-4-2 – Comparaison entre les lots des caractéristiques moyennes test de l’analyse de la variance(ANOVA)
2-2-4-3 – Recherche de groupes de lots homogènes,
Méthode de la plus petite différence significative (p
Méthode de Tukey
2-2-4-4 – Test de Dunett
3-RESULTATS ET INTERPRETATIONS
3-1 – Résultats des analyses de la variance univariée
3-1-1 – Description des données
3-1-1-1 – Lot Témoin
3-1-1-2 – Lot V1
3-1-1-3 – Lot V2
3-1-2 – Résultats de l’analyse de la variance univariée (ANOVA)
3-2 – Résultats statistiques de la Méthode de la plus petite différence significative p
3-3 – Résultats du test de Dunett
3-4 – Représentations graphiques et interprétations
3-4-1 – Représentations graphiques des variables biochimiques Glucose, Cholestérol, Triglycérides
3-4-2- Représentations graphiques des paramètres hormonaux Cortisol, TSH, T3, T4, Testostérone
3-4-3-Représentation graphiques des paramètres immunitaires humoraux IgG, IgM
4-DISCUSSION
4-1– Discussion des Paramètres biochimiques
4-1-1 – Le glucose
4-1-2 – Cholestérol et triglycérides
4-2- Discussion des paramètres hormonaux
4-2-1 – Le cortisol 56
4-2-2 – Les hormones thyroïdiennes
4-2-3 – La Testostérone
4-3 – La réponse immunitaire humorale (IgG, IgM)
4-4 – Données épidémiologiques concernant l’état de stress post traumatique
4-5 – Critères diagnostiques d’un état de stress post traumatique
5-CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
