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Différentes méthodes existantes
Il existe aujourd’hui différentes stratégies de simulations disponibles pour étudier la dynamique d’un système. Toutes ne sont pas adaptées à chaque problématique, il est important de choisir la méthode de dynamique en fonction du cas étudié et l’objectif final. Ce paragraphe évoque dans un premier temps : une liste non exhaustive de différentes méthodes de simulations existantes et leurs applications puis se focalise sur les méthodes utilisées au cours de ma thèse.
Simulations gros grains
Il est important de réaliser que la durée d’une simulation à effectuer dépend de différents facteurs, bien sûr de l’échelle de temps du processus physique à atteindre, mais aussi de la taille du système biologique comme il a été notifié précédemment pour la modélisation moléculaire. La méthode gros grains(227) connue sous le nom de ‘coarse grain’ en anglais a été développée spécialement pour des gros systèmes, pour lesquels une simulation standard serait trop couteuse.
Pour pouvoir étudier ces systèmes et contourner cette contrainte de temps, le principe de cette méthode est de changer la représentation géométrique du système pour qu’un point ne représente plus un unique atome mais un ensemble d’atomes partageant les mêmes propriétés physico-chimiques. L’effet du solvant aussi est pris en compte dans cette réduction.
L’algorithme de simulation reste inchangé malgré ce changement, ainsi les paramètres de champ de forces vont être modifiés en conséquence en utilisant par exemple un champ de force très populaire : le champ de force Martini(228). Pour empêcher toute déstructuration des structures secondaires, les champ de forces gros grains intègrent un réseau élastique. Ce dernier permet de prendre en compte les interactions entre les structures secondaires. D’autres champ
de force gros-grains n’imposant pas de contraintes ont aussi été développés tel que « sirah force field » implémentés dans AMBER et GROMACS (http://www.sirahff.com/)
Ces méthodes ont l’avantage de pouvoir réaliser des simulations de plus longues durées sur des systèmes de grande taille. L’inconvénient principal de ces méthodes est que la représentation réduite du système moléculaire ne permet pas de décrire les mouvements locaux du système avec une bonne précision, ni de décrire les interactions précises à l’échelle atomique.
Dynamique Moléculaire dirigée
La question du temps de simulation reste une question sensible : comme en témoigne la méthode par gros grains qui sacrifie une part de précision pour atteindre une échelle de temps plus grande. Cependant, l’une des applications majeures des simulations est de comprendre le processus d’un mécanisme moléculaire à une échelle atomique plus précise, ce que ne permet pas le modèle à gros-grain. Malheureusement, la durée réelle des processus peut atteindre la milliseconde voire la seconde. Ces temps de simulations ne sont pas atteignables par les simulations actuelles à l’échelle atomique malgré des avancées sur cette question.
La dynamique moléculaire dirigée(229) (connue sous le nom de Targeted Molecular Dynamic en anglais) donne la possibilité d’ignorer les échelles de temps. Pour recourir à cette méthode, il est nécessaire de disposer de la structure sous deux formes : la structure de départ et la structure cible. Les deux structures doivent être identiques en topologie. Les deux structures sont comparées en réalisant le calcul de ‘Root-Mean Square Deviation’ (RMSD) permettant de calculer la similitude conformationnelle de deux structures entre elles. Plus cette valeur est faible, plus les structures sont proches d’un point de vue structural.
L’avantage de cette procédure est de distinguer le chemin suivi par le système pour atteindre la conformation cible. L’inconvénient majeur est que la possibilité de distinguer des états de transition ou encore des états de conformations plus stables est fortement réduite à cause d’un manque d’échantillonage étendu de l’espace conformationnel.
Recuit simulé
Lors d’une simulation de dynamique moléculaire classique, le système explore son espace conformationnel qui comporte différents minima locaux d’énergie. Lorsque la structure est piégée dans un de ces minima représentant un puits de potentiel, le temps de simulation effectué par dynamique moléculaire n’est parfois pas suffisant pour pouvoir observer la sortie de ce puits et d’explorer d’une façon plus étendue l’espace conformationnel ce qui empêche de découvrir d’autres puits de plus basse énergie et donc plus favorables pour la structure.
Pour contourner ce problème, l’idée fut de s’appuyer sur une méthode initialement destinée à la métallurgie en 1983(230). Cette méthode repose sur le fait qu’un refroidissement brutal du système ne lui permet pas d’optimiser son organisation dans son état le plus stable ; ainsi un refroidissement contrôlé à partir d’une température élevée donnerait au système l’opportunité d’optimiser sa structure. En adaptant cette méthode aux simulations de système biologiques, les chercheurs ont ajouté de l’énergie cinétique au système afin d’augmenter sa température lorsque le système se retrouvait dans un puits de potentiel duquel il ne pouvait s’extraire. Suite à cette augmentation de température, sa décroissance est contrôlée jusqu’à atteindre un minimum local d’énergie.
Métadynamique
La métadynamique(231, 232) est une autre méthode développée pour contourner la contrainte du temps de simulation qui empêche d’atteindre des structures de transition ou de structures d’états différents. Grâce à cette méthode les simulations peuvent évoluer à des échelles de temps plus grandes. L’objectif de la métadynamique est d’optimiser l’échantillonnage des simulations. Elle est très proche de la dynamique moléculaire classique à l’exception de l’introduction d’un biais. Ce biais va agir sur certains degrés de liberté du système par l’intermédiaire de variables collectives dont le choix est laissé au soin de l’utilisateur. Ces dernières doivent satisfaire trois critères : elles doivent distinguer nettement les états initiaux, intermédiaires et finaux ; décrire les événements lents ciblés dans la recherche ; et dans un dernier temps être peu nombreuses pour assurer la convergence. Ces variables sont souvent des éléments géométriques tels que des distances, des angles, des dièdres par exemple. Ces simulations cartographient les énergies des différentes structures obtenues et détectent ainsi les différents états clés du système.
Le point fort de l’accès à ces échelles de temps implique la possibilité de visualisation d’événements rares tels que des associations ligand/récepteur ou encore des dissociations. Malgré les avancées permises par cette méthode, il faut garder en tête que la plupart des transitions conformationnelles ne sont toujours pas accessibles. En effet, l’espace.
Table des matières
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
INTRODUCTION
1 PARTIE 1 : CONTEXTE BIOLOGIQUE
1.1 CHAPITRE 1 : LES DIFFERENTS CANAUX POTASSIQUES
1.1.1 Les canaux activés par le calcium
1.1.2 Les canaux à deux pores
1.1.3 Les canaux dépendants du potassium
1.1.4 Les canaux à rectification entrante
1.2 CHAPITRE 2 : LES CANAUX A RECTIFICATION ENTRANTE KIR.
1.2.1 Les différentes sous-familles
1.2.2 Fonctionnement du canal
1.2.2.1 Le potentiel de repos transmembranaire
1.2.2.2 Le potentiel d’action
1.2.2.3 La rectification entrante des canaux Kir
1.2.2.4 Facteurs d’influence sur l’activité des canaux Kir
1.2.3 Structure du canal
1.2.3.1 Présentation générale
1.2.3.2 Les canaux Kir2.1
1.2.3.3 Le canal Kir6.2
1.2.3.4 Le canal KirBac3.1
1.2.4 Pathologies
1.2.4.1 Pathologie dépendante du canal Kir2.1 : le syndrome d’Andersen
1.2.4.2 Sièges de mutations pathologiques pour Kir2.1
1.2.4.3 Pathologie dépendante du canal Kir6.2 : l’hyperinsulinisme
1.2.4.4 Sièges de mutations pathologiques pour Kir6.2
2 PARTIE 2 : ETUDE DU GATING DU CANAL BACTERIEN KIRBAC3.1
2.1 CHAPITRE 1 : ETUDES IN SILICO DU CANAL
2.1.1 Modélisation Moléculaire
2.1.1.1 Les différentes approches en Modélisation Moléculaire
2.1.1.1.1 Méthodes de premier principe sans information issue de bases de données
2.1.1.1.2 Méthodes de premier principe avec information issue des bases de données
2.1.1.1.3 Reconnaissance de repliements et méthodes de « filetage » (threading)
2.1.1.1.4 Modélisation comparative avec des stratégies d’alignement de séquence
2.1.1.2 Modélisation par homologie avec Modeller.
2.1.1.2.1 Modélisation de la membrane
2.1.2 Simulations
2.1.2.1 Différentes méthodes existantes
2.1.2.1.1 Simulations gros grains
2.1.2.1.2 Dynamique Moléculaire dirigée
2.1.2.1.3 Recuit simulé
2.1.2.1.4 Métadynamique
2.1.2.2 Principe de la dynamique Moléculaire
2.1.2.2.1 Théorie/Principe
2.1.2.2.2 Paramètres de champ de forces
2.1.2.2.3 Algorithme de Leapfrog-Verlet.
2.1.2.2.4 Contrôle de la pression et de la température
2.1.2.2.5 Contraintes
2.1.2.3 Les Modes Normaux
2.1.2.3.1 Théorie/Principe
2.1.2.3.2 Analyse des modes normaux
2.1.2.3.3 Générations des structures déplacées le long des modes
2.1.2.4 La méthode MDeNM : Molecular Dynamics using excited normal modes
2.1.2.4.1 Principe
2.1.2.4.2 Première étape : préparation des données
2.1.2.4.3 Seconde étape : Sélection et combinaison des modes normaux
2.1.2.4.4 Troisième étape : Excitation
2.1.2.4.5 Clustering et Relaxation des structures excitées
2.1.3 Echange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse : HDX-MS
2.2 CHAPITRE 2 : ETUDE DU MECANISME D’OUVERTURE/FERMETURE DU CANAL BACTERIEN KIRBAC3.1
2.2.1 Abstract
2.2.2 Introduction
2.2.3 Results
2.2.3.1 Theoretical data
2.2.3.1.1 Channel constriction points
2.2.3.1.2 Selection of modes contributing to the gating
2.2.3.1.3 Population of open and closed states from the relaxed structures issued from MDeNM simulations 71
2.2.3.1.4 Implication of global and local motions to the gating
2.2.3.1.5 Side-chains rotational motions of residues at the constriction regions associated to gating
2.2.3.1.6 Correlations between types of global motions and gating from the relaxed structures obtained following MDeNM simulations
2.2.3.2 Experimental data
2.2.3.2.1 Hydrogen/Deuterium exchange coupled to mass spectrometry (HDX-MS)
2.2.3.2.2 Current recordings of KirBac3.1 in planar lipid bilayers
2.2.4 Discussion
2.2.5 Materials and Methods
2.2.5.1 Molecular Modeling and Dynamics
2.2.5.2 Normal Modes
2.2.5.3 Selection of a subset of most contributing normal modes to channel gating
2.2.5.4 Molecular Dynamics using Excited Normal Modes (MDeNM).
2.2.5.5 Relaxation of the excited MDeNM structures.
2.2.5.6 Protein expression and purification
2.2.5.7 Pepsin Digestion
2.2.5.8 Hydrogen/Deuterium exchange approach coupled to mass spectrometry (HDX-MS)
2.2.5.9 HPLC Peptide Separation
2.2.5.10 Mass Spectrometric Analyses of Peptides
2.2.5.11 Electrophysiology
2.2.6 References
2.2.7 Acknowledgments
2.2.8 Supplementary
2.2.8.1 Introduction
2.2.8.2 Results and Discussion
2.2.8.3 Discussion
2.2.8.4 Material and methods
2.3 CHAPITRE 3 : IMPACT DE LA MUTATION W46R SUR LE MECANISME D’OUVERTURE/FERMETURE DU CANAL BACTERIEN KIRBAC3.1
2.3.2 Abstract
2.3.3 Introduction
2.3.4 Results
2.3.4.1 Crystallographic Structure
2.3.4.2 HDX-MS measurements
2.3.5 Theoretical Results
2.3.5.1 Interaction Networks
2.3.5.2 Contacts between residues
2.3.5.3 Impact of the mutation on the gating
2.3.5.4 Population of open and closed states from the relaxed structures issued from MDeNM simulations 128
2.3.6 Discussion
2.3.7 Materials and methods
2.3.7.1 Protein expression purification
2.3.7.2 Theoretical data
2.3.7.2.1 Modeling and Dynamics
2.3.7.2.2 Normal Modes
2.3.7.2.3 Molecular Dynamics using excited Normal Modes
2.3.7.2.4 Relaxation of the excited MDeNM
2.3.7.2.5 Interaction networks
2.3.7.2.6 Structural determinants
2.3.8 Supplementary
2.4 CHAPITRE 4 : IMPACT DE LA MUTATION S129R SUR MECANISME D’OUVERTURE/FERMETURE DU CANAL BACTERIEN KIRBAC3.1
2.4.1 Abstract
2.4.2 Introduction
2.4.3 Results and discussion
2.4.3.1 Theoretical data
2.4.3.1.1 Points of constrictions at the bottom of the channel in the KirBac3.1 WT and the mutant S129R 148
2.4.3.1.2 π -Interaction between the side chain of Arg129 and the aromatic ring of Tyr132
2.4.3.1.3 State of gating at the level of the various constriction points
2.4.3.1.4 Structural modifications between the closed (KirBac3.1 WT) and open states (KirBac3.1 S19R)
2.4.3.2 Experimental data
2.4.3.2.1 Hydrogen/Deuterium exchange approach coupled to mass spectrometry (HDX-MS)
2.4.3.2.2 Structural flexibility in the transmembrane during the gating
2.4.3.2.3 Cytoplasmic domain
2.4.3.3 Conclusion
2.4.3.4 Materials and Methods
2.4.3.4.1 Molecular Modelling.
2.4.3.4.2 Normal Modes.
2.4.3.4.3 Molecular Dynamics using Excited Normal Modes.
2.4.3.4.4 Clustering of the excited (MDeNM) structures.
2.4.3.4.5 Molecular Dynamics Simulations.
2.4.3.4.6 Analysis of Molecular Dynamics simulations.
2.4.4 Acknowledgments
2.4.5 References
3 PARTIE 3 : CRYO-MICROSCOPIE ELECTRONIQUE, METHODOLOGIE ET DETERMINATION DE LA STRUCTURE 3D DU CANAL KIR2.1
3.1 CHAPITRE 1 : ANALYSES D’IMAGES ISSUES DE CRYO-MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
3.1.1 Cryo-microscopie
3.1.2 Prise d’images
3.1.2.1 Préparation de l’échantillon
3.1.2.2 Microscopie électronique à transmission
3.1.2.3 Aberrations et astigmatisme
3.1.3 L’image
3.1.3.1 Formation de l’image
3.1.3.2 Fonction de transfert de contraste: CTF
3.1.3.3 Correction de la CTF
3.1.3.4 Estimation de la CTF
3.1.3.5 Caméra
3.1.4 Analyse d’images
3.1.4.1 Alignement des micrographes enregistrés par la caméra
3.1.4.2 Détection des particules
3.1.4.3 Génération d’un modèle initial.
3.1.4.4 Normalisation des données
3.1.4.5 Alignement des particules
3.1.4.6 Classifications 2D et 3D
3.1.4.7 Principe de la reconstruction 3D
3.1.4.8 Reconstruction 3D
3.1.4.9 Affinement de la densité électronique
3.1.4.10 Fourier Shell Correlation : FSC
3.1.5 Fitting de la structure 3D
3.2 CHAPITRE 2: DETERMINATION DE LA STRUCTURE DE KIR2.1 PAR CRYO-MICROSCOPIE
3.2.1.1 Introduction
3.2.1.2 Results
3.2.1.2.1 Expression, purification and biochemical characterization of the human Kir2.1 channel
3.2.1.2.2 Image Analysis
3.2.1.2.3 Functional studies
3.2.1.3 Methods
3.2.1.3.1 Expression of the human Kir2.1 channel
3.2.1.3.2 Purification of the human Kir2.1 channel.
3.2.1.3.3 SDS/PAGE and Western blotting
3.2.1.3.4 Functional activity of the channel
4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
5 BIBLIOGRAPHIE
6 ANNEXES
6.1 ETUDE DE LA STRUCTURE DU COMPLEXE CYCLODEXTRINE-ADN PAR CRYO-MICROSCOPIE.
6.1.1 Contexte et Objectif
6.1.2 Résultats
6.1.3 Conclusions
6.1.4 Méthodes
6.1.4.1 Préparation
6.1.4.2 Microscopie
7 TABLE DES ILLUSTRATIONS
8 TABLE DES TABLEAUX
