OMM-CLIC
Pêche à la ligne
La canne à pêche est l’instrument de pêche utilisé. Elle est composée d’un bâton rigide à extrémité souple (tige de bambou ou de roseau), plus ou moins long, sur lequel ont été attachés une ligne et un appât pour attirer les poissons. Les appâts utilisés sont les vers de terre. Cet engin de pêche a été utilisé lors des captures dans les lacs de Nosy Be qui sont très profonds et dont cet instrument de pêche est le seul autorisé.
Préparation des spécimens capturés
Après la fin de chaque capture pour une station donnée, une prise de photo sur chaque individu de poisson, en vue latérale gauche, la face encore intacte car non utilisée pour le prélèvement génétique, a été effectuée. L’individu a été placé dans un aquarium rempli d’eau et le tout est placé dans un endroit où la luminosité est bonne pour la photographie. Ces photos permettent une observation ultérieure des caractéristiques phénotypiques des poissons capturés même si d’éventuelles transformations pourraient survenir lors de la conservation. Après la photographie, chaque spécimen a été muni de deux étiquettes portant chacun un numéro : une étiquette RDR portant le numéro de terrain et une étiquette UADBA pour une collection du Département de Biologie Animale.
Une fois les poissons photographiés et étiquetés, une petite portion (correspondant à 1g) de la nageoire pectorale droite a été prise pour servir d’échantillon lors de la détermination génétique du specimen. Chaque tube de conservation de l’échantillon, contenant de l’alcool 90°, est spécifique à chaque individu collecté et porte le même numéro que celle de l’étiquette. Enfin, pour la préservation des spécimens de poissons capturés, une solution de formol à 10% a été utilisée. Cela permet une conservation en taille et en forme de tous les éléments constitutifs de chacun de ces spécimens.
Travaux au laboratoire
Cette étude consiste à compiler les données en utilisant l’échantillon de poisson dans le laboratoire de Biologie des Populations Aquatiques (LBPA) au Département de Biologie Animale à l’Université d’Antananarivo – Madagascar d’une part et les échantillons de tissus de poissons au Zoological Institute, Technical University of Braunschweig – Allemagne, d’ autre part.
Etude génétique
Méthode d’identification moléculaire
Les travaux de laboratoire concernant l’identification moléculaire ont été effectués par Dr. Randrianiaina Roger Daniel et Prof. Dr. Vences Miguel à l’Université Technique de Braunschweig en 2012 et à l’Université Ludwig-Maximilians de Munich en Allemagne en 2013. Ces travaux se déroulent en trois étapes : l’extraction, l’amplification et le séquençage de l’ADN.
L’ADN génomique total a été extrait des échantillons de tissus à l’aide de la digestion de protéinase K d’une concentration de 10 mg/ml, suivi d’un protocole d’extraction de sel standard selon Bruford et al. (1992). Un fragment d’ADN mitochondrial, d’environ 700 paires de bases, de la Cytochrome Oxidase sous unité I (COI) a été amplifié en utilisant les amorces développés par Hebert et al. (2004), Ward et al. (2005) et Ivanova et al. (2006, 2007). La COI a été choisie en raison (1)de la disponibilité des amorces qui fonctionnent aisément pour les vertébrés (poissons inclus), et (2)de l’existence d’une base de données moléculaires énorme facilitant la comparaison des séquences obtenues.
Analyse des séquences obtenues
Après l’acquisition des 42 séquences d’ADN qui ont été enregistrés sur des fichiers de type ab1, plusieurs étapes de reconstruction ont été effectuées par l’auteur en cette année 2015. Ces 42 séquences correspondent à celles des 41 specimens de Cichlidés et une séquence du groupe externe. Ce goupe à part n’appartient pas aux Cichlidés mais n’est pas très éloigné de ces derniers (WilliHennig, 1950). Les étapes de reconstruction sont primordiales pour la préparation à la construction d’un arbre phylogénétique.
Contrôle de la qualité de chaque séquence
Tous les fichiers ab1 au nombre de 42 correspondantchacun à une séquence donnée, ont été ouverts avec le logiciel CLC Main Workbench6.8.2 (http://www.clcbio.com.).
Le but de cette analyse est de contrôler la qualité des séquences d’ADN. Ce contrôle a été possible grâce à la disponibilité des électrophorégrammes et des diagrammes en bâtons (figure 4). Le procédé de contrôle consiste à observer la qualité de l’électrophorégramme (voir si les pics sont bien nets ou s’il existe deschevauchements entre les pics), à détecter les erreurs (vérifier si chaque pic correspond bien à la base mentionnée dans la séquence) et à rectifier les anomalies rencontrées (par élimination ou substitution ou insertion d’une nouvelle base). Les portions au début et à la fin d’une séquence où chacun des pics ne sont pas bien distinguables (existence de plusieurs chevauchements) induisant à une incertitude ont été supprimées. Pour chaque séquence, les portions coupées devraient être de même taille pour faire en sorte que le nombre de bases restant soit égal.
Premier alignement et deuxième contrôle qualité
En utilisant toujours le même logiciel CLC, après élimination des mauvaises portions, les séquences ont été alignées. Le but est de faireen sorte que la séquence de chaque espèce débute à un même niveau pour faciliter le deuxième contrôle qualité. Ce deuxième contrôle consistait à observer la succession une à une des bases pour des espèces voisines et à détecter les sites informatifs. Ces derniers sont des sites qui ont au moins deux nucléotides différents, représentés chacun par au moins 2 exemplaires.
La figure 4a présente une portion de la séquence d’ADN se situant entre les bases 193 et 265 de quelques individus appartenant au genre Ptychochromis. Les pics sur l’électrophorégramme sont bien nets et le niveau des histogrammes est élevé.
La figure 4b montre d’autres portions de séquence d’ADN des individus de Paretroplus polyactis. La présence des pics qui se chevauchent et le niveau très bas de l’histogramme montrent une mauvaise qualité de cette portion.
Calcul de la distance génétique
Pour calculer la distance génétique, l’alignement obtenu dans le logiciel MEGA a été utilisé. Le calcul est basé sur la méthode p-distances consistant à estimer le nombre de substitutions nucléotidiques puis à calculer la proportion entre les sites ayant des différences et le nombre total de sites (WilliHennig, 1950).
Construction d’un arbre phylogénétique
Construire des arbres phylogénétiques exige la compréhension des principes de l’évolution moléculaire. Les changements observés sur un site donné sont causés par des mutations (transition ou transversion). La qualitéd’un modèle évolutif est liée à la qualité de la représentation des changements (Zvelebil & Baum,2007). Pour ce faire, le fichier de type fasta du résultat de l’alignement MEGA est ouvert avec le logiciel j-Model test 2.1.7. Son principe est d’avoir un ∆AIC égal à 0 (Akaike, 1974).
Le logiciel Mr Bayes 3.2 est ensuite utilisé pour obtenir un arbre de consensus. Le type de fichier compatible à ce logiciel est le nexus. Ainsi une transformation du fichier de type fasta en nexus a été effectuée en ligne (http://www.sequenceconversion.bugaco.com/.) en utilisant le fichier de type fasta et le résultat du modèle d’évolution qui est le « GTR + G » (pour servir de commande). Le fichier nexus obtenu a été par la suite ouvert avec le logiciel.
Mr Bayes. Le premier processus dans ce logiciel consiste à un paramétrage. Il s’agit de spécifier des paramètres nécessitant une précision comme : le nombre de générations qui signifie le nombre d’arbres à construire (pour l’étude = 2 millions de générations signifiant que le logiciel va construire 2 millions d’arbres différents par la méthode de « bootstrap »), la fréquence d’échantillonnage (égale à 100 signifiant qu’à chaque 100 arbres construits, un arbre pris au hasard constitue le résultat) et le taux d’ignorance (ici = 0,25, ceci signifie que l’analyse ignore 25% des 2 millions d’arbres considérés comme de mauvaise qualité). Après ce premier processus, la commande mcmc ou logarithme de Markov test de Monte Carlo a été lancée.
Pour avoir une idée sur la qualité de l’analyse à la fin des 2 millions de générations, une vérification a été effectuée dans le logiciel Tracer. De ce logiciel ont été ouverts les résultats issus de Mr Bayes ; une image (trace file) montrantla qualité de l’analyse a été par la suite obtenue. Lorsque celle-ci est sous forme d’un plateau (signifiant que la phase exponentielle n’est plus présente), le graphe est plus ou moins constant oscillant autour d’une même valeur.
L’arbre qui en ressort est fiable et le nombre de générations considéré est juste.
Enfin, la première analyse a été stoppée lorsque la valeur moyenne standard de la fréquence donnée dans le résultat de Mr Bayes est proche de 0 (Akaike, 1974). La commande utilisée a été de compacter les 5% des 20 000 arbres obtenus (ce qui équivaut à 1 000 arbres) et de donner l’arbre correspondant. L’arbre de consensus est obtenu par une exploration de ces 1000 topologies alternatives suivie d’une sélection de celle ayant la plus grande probabilité.
Ce dernier processus termine la construction de l’arbre phylogénétique. Le résultat final obtenu de Mr Bayes, sous forme de fichier nexus, a été ouvert avec le logiciel Figtree version 1.4.2. Dans ce logiciel, des rotations ont été faites pour faciliter l’interprétation et apprécier la direction de l’évolution. Une option permettant d’apprécier le taux de relation (en %) entre les branches de l’arbre final a été a été utilisée ; ainsi le degré de lien existant entre les espèces étudiées est connu.
Etude des caractères externes
Pour étudier les caractères externes, la méthode de Dyer & Chernoff (1995) a été utilisée. Une liste des caractères à observer et des états de caractères correspondant, a été élaborée avant le début des manipulations au laboratoire. Le choix des caractères a été basé sur les caractéristiques de la famille des Cichlidés proposés par Paugy et al. (2007). Au total, 45 caractères ont été étudiés.
Après avoir choisi les caractères, un codage des états de caractère a été fait. Le mode de codage prend en compte l’état de caractère qui est primitif. Ainsi ce dernier a été codé de 0, et le codage évolue en fonction de la dérivation de l’état des caractères (un état caractère encore peu dérivé est codé du chiffre 1 et un autre qui est plus évolué est codé de 2 et ainsi de suite).
Un seul code est attribué à chaque état de caractères. Les caractères, les états de caractère et leurs codes correspondant sont listés en Annexe IV.
Les données saisies dans Excel ont été ensuite compilées en une matrice de données copiée dans un fichier bloc note. La matrice ainsi obtenue (Annexe VII) a été traitée dans un logiciel spécifique en ligne (http://www.genomes.urv.cat/UPGMA/index.php.), le DendroUPGMA (Vallve et al., 1999). Le programme calcule une matrice de similitude, puis transforme les coefficients de similitude en distances et fait grouper les taxa deux à deux en utilisant la méthode de groupe de paire d’UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetic mean). Pour cette étude, le coefficient utilisé est le RMSD ou Root-Mean SquareDistance, une méthode robuste pour évaluer la signification statistique de la différence entre deux valeurs.
L’output obtenu a été copié dans un fichier bloc note. Cet output a été inséré par la suite dans le logiciel FigTree version 1.4.2. Enfin, dans ce dernier, le «phylogramme» ou arbre avec échelle de distances a été construit.
Etude morphologique
D’après Helfman (2007), pour n’importe quelle classification employée, l’étude des caractères est nécessaire pour différencier les taxa et d’obtenir leurs interrelations. Après la construction du phylogramme, des mensurations de 42 spécimens de poissons suivies d’un comptage des caractères méristiques sur ces mêmes specimens, ont été effectués.
Mensurations et calcul des distances
Les caractères morphométriques se réfèrent surtout aux structures mesurables. La mensuration des 26 paramètres étudiés a été effectuée à l’aide d’un pied à coulisse D20TN Mitutoyo (Annexe II) de 200 mm de longueur et dont la précision est de 0,02 mm. Ces paramètres font référence à ceux proposés par Paugy et al. (2007) pour les études des Cichlidés, puis adaptés selon les besoins de l’auteur. Toutes les mensurations effectuées sur la face latérale du poisson ont été prises dans la partie gauche. La figure 6 montre les paramètres morphométriques sur la partie latérale d’un poisson.
b- Comptages Les caractères méristiques correspondent aux myomères (ségmentation du corps), comme le nombre de rayons des nageoires. Mais actuellement, ce caractère est aussi associé au nombre d’écailles, à celui d’épines branchiales,etc. Pour cette étude, un comptage à l’œil nu ou sous une loupe binoculaire, des rayons des nageoires (dorsale et anale) et d’écailles le long des lignes longitudinale, latérale et sur l’opercule a été effectué. Au total, 8 caractères ont été comptés :
– le nombre de rayons durs de la nageoire dorsale (nommé dorsal dur), puis celui des rayons mous (nommé dorsal mou) de ce même nageoire. Le comptage des rayons de la nageoire anale a été fait de la même manière ;
– le nombre d’écailles sur la ligne longitudinale (NeLLo) correspondant au nombre d’écailles percées le long de la ligne, allant de l’opercule jusqu’à la base de la nageoire caudale.
– le nombre d’écailles en ligne latérale (NeLLa) s’agissant du nombre d’écailles percées comptées le long de la ligne latérale, de l’opercule jusqu’à la base de la nageoire caudale.
Cette ligne latérale représente l’organe sensoriel du poisson. En fait le support du système nerveux s’extériorise par une ligne d’écailles perforées où aboutissent des terminaisons nerveuses. Si la ligne latérale est incomplète, le nombre d’écailles est compté de la même façon mais en ligne longitudinale. Lorsque deux lignes latérales sont présentes, le nombre d’écailles percées le long de la ligne latérale supérieure (NeLLaS), de l’opercule à la dernière écaille perforée et celui de la ligne latérale inférieure (NeLLaI) de la première écaille percée jusqu’à la dernière écaille perforée se trouvant à la base de la caudale ont été comptées ;
– le nombre d’écailles se trouvant sur l’opercule (NeO) a été aussi compté.
c- Analyse statistique Les analyses statistiques des données ont été effectuées sur SPSS ou Statistical Package for the Social Sciences version 17.00. Pour cette étude le test de Mann-Whitney et l’ACP ont été utilisés pour analyser les données issues de l’étude des paramètres morphométriques et méristiques.
Test de Mann-Whitney(Scherrer, 1984)
Le test de Mann-Whitney est un test non paramétrique. Ce test cherche à vérifier si les éléments de deux groupes, classés par ordre croissant sur une même échelle ordinale, occupent des positions (rangs) équivalentes révélant ainsi la similitude des deux distributions.
Pour cette étude, le but est de savoir lesquels des paramètres permettent de distinguer deux groupes ; en d’autres termes, les deux groupes présentent-ils les mêmes caractères morphologiques étudiés ; si non par quels paramètres ils se distinguent ?
Le test a été effectué en utilisant des valeurs relatives pour les paramètres morphométriques (paramètres variables en fonction de l’âge) et des valeurs exactes pour les caractères méristiques (paramètres de valeurs plus ou moins constantes quel que soit l’âge considéré). L’utilisation des valeurs relatives pour les paramètres morphométriques est fondamentale pour avoir des données standardisées sachant que l’opération effectuée s’agitd’un classement. Comme la longueur standard du corps du poisson est considérée comme une valeur standard, ce paramètre est utilisé dans la standardisation des données. Ce procédé de standardisation se fait par la division de chaque paramètre morphométrique d’un poisson donné par la longueur standard de son corps. Par exemple, la valeur relative du diamètre de l’oeil d’un spécimen de poisson notée rel dO est obtenu en divisant le diamètre de l’oeil (dO) par la longueur standard de son corps (LS).
Table des matières
REMERCIEMENT
RESUME
ABSTRACT
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES ANNEXES
GLOSSAIRE
INTRODUCTION
I- MATERIELS ET METHODES
I.1. Présentation des sites d’étude
I.2. Présentation des matériels biologiques
I.2.1. Présentation des genres étudiés
I.2.2. Matériels biologiques
I.3. Travaux sur le terrain
I.3.1. Etude des paramètres physico-chimiques
I.3.2. Collecte des échantillons biologiques et opérations post-captures
I.3.2.1.Technique de capture des poissons
a- Capture à l’aide d’un filet maillant
b- Pêche électrique
c- Pêche à la ligne
I.3.2.2.Préparation des spécimens capturés
I.4. Travaux au laboratoire
I.4.1. Etude génétique
I.4.1.1. Méthode d’identification moléculaire
I.4.1.2. Analyse des séquences obtenues
a- Contrôle de la qualité de chaque séquence
b- Premier alignement et deuxième contrôle qualité
c- Deuxième alignement
d- Calcul de la distance génétique
I.4.1.3. Construction d’un arbre phylogénétique
I.4.2. Etude des caractères morphologiques et phénotypiques
I.4.2.1. Etude des caractères externes
I.4.2.2. Etude morphologique
a- Mensurations et calcul des distances
b- Comptages
c- Analyse statistique
Test de Mann-Whitney
Analyse des composantes principales
II. RESULTATS ET INTERPRETATIONS
II.1. Espèces collectées et étudiées
II.2. Systématique moléculaire
II.3. Caractères morphologiques et phénotypiques
II.3.1. Systématique morphologique
II.3.2. Caractères morphométriques et méristiques
II.3.2.1. Résultats des mensurations et comptages
II.3.2.2. Résultats des tests statistiques
a- Test de Mann-Whitney
– Entre les genres étudiés
– Entre les espèces étudiées
b- Résultats de l’Analyse des Composantes Principales
II.4. Paramètres physico-chimiques des sites d’étude
III. DISCUSSION
III.1. Systématique
III.1.1. Identités des espèces étudiées
III.1.2. Similarités et différences entre la systématique moléculaire et la classification morphologique
III.1.3. Systématique et évolution
III.2. Qualité des habitats et préférence des espèces
III.3. Menaces actuelles et actions de conservation entreprises
III.4. Limites de la méthodologie et solutions adoptées
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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