Mode de cristallisation

Trois modes de cristallisations ont été envisagés afin de déterminer comment conduire l’opération permettant d’obtenir tel ou tel polymorphe en solution aqueuse :
– cristallisation discontinue par refroidissement où la sursaturation est obtenue par diminution de la température (Figure 8a) ;
– cristallisation isotherme en mode semi-continu où la sursaturation est obtenue par concentration de la solution dans le cristalliseur (Figure 8b) ;
– et un couplage cristallisation par refroidissement/isotherme.

RESULTATS

Cristallisat ion isot her me (semi-cont inue)

Deux réacteurs thermostatés sont utilisés. Le premier est un réacteur d’alimentation contenant une solution saturée de concentration Csa à une température Ta . Cette solution est introduite avec un débit constant, par l’intermédiaire d’une pompe, dans le réacteur de cristallisation maintenu à une température Tc (°C). Une solution saturée de concentration Csc se trouve initialement dans le cristalliseur. La concentration Csc est la concentration à saturation d’une solution de glycine à (Tc – 2)°C. Pour cristalliser, la température du réacteurde cristallisation est inférieure à la températurede la solution d’alimentation Ta . Les solutions sont agitées à 350 tr.min -1 . La durée de chaque expérience est fixée à 30 minutes.
Plusieurs combinaisons de débit et de température de cristallisation ont été testées (Tableau 2). Les cristaux sont caractérisés par des analyses d’image (AI), des analyses DSC et DRX. La cristallisation des polymorphes dépend de la température de cristallisation T c. En effet, les cinétiques de nucléation et de croissance sont fonction de la concentration de la solution [Jie 2007 ; Kitamura 2003 ; Threlfall 2000].L’influence du débit d’alimentation a été étudiée en mode semicontinu à différentes températures de cristallisation. En effet, le débit conditionne le niveau de sursaturation de la solution qui influe sur les taux de nucléation et de croissance.
Pour les faibles températures, des cristaux de forme aiguille ont été obtenus quel que soit le débit utilisé. Les cristaux aiguilles ne donnent aucun signal de transition en DSC et l’analyse DRX montrent que ce sont de la glycine αpure. La glycine γest totalement absente de ces cristaux. Pour des températures de cristallisation supérieures à 38°C, des cristaux de glycine de forme de bipyramide sont obtenus. L’analyse DSC montre l’existence d’un pic de transition vers 160°C, caractéristique de la forme γ. L’intensité de ce pic est faible pour les débits plus élevés et l’analyse DRX des cristaux ne donne pas la raie caractéristique de la glycine γ. Le pic thermique de très faible intensité ne traduit donc qu’une présence detrace de glycine γqui, selon Veesler, ne peut par être détecté par DRX [Veesler 2003]. Pour un débit plus faible (6,9 g.min -1 ) et une température de cristallisation de 54 °C, le pic de DSC est très important et l’analyse DRX montre la présence de 5 % glycine γ.

Cristallisation par refroidissement

Lors d’une cristallisation par refroidissement, la vitesse de refroidissement est un paramètre très important. Elle conditionne le niveau de sursaturation et la largeur de la zone métastable. Des études de la vitesse de refroidissement (V r ) et de la température initiale (Ti ) de cristallisation sont alors effectuées.
Les cristallisations sont réalisées dans un réacteur double enveloppe dans laquelle circule un fluide caloporteur. Un cryothermostat Huber CC 415 muni d’une sonde Pt 100 immergée dans la solution permet le contrôle de la température. L’agitation est assurée par un mobile de type Rushton tournant à 350 tours par minute.
Une solution saturée de glycine est préparée à une température initiale Ti (°C) correspondant à une concentration initiale Ci (g de glycine /100 g d’eau). La masse de solvant est fixée à 300 g pour toutes les concentrations étudiées. Le solide étant complètement dissous, le programme de température est appliqué selon la vitesse de refroidissement utilisée jusqu’à la température finale Tf.
L’écart entre la température initiale Ti et la température finale Tf est toujours de 30°C pour toutes les expériences. La solution est maintenue 10 minutes à cette température puis le cristalliseur est vidangé et la solution est filtrée. Les cristaux sont lavés au méthanol puis séchés dans un endroit sec pour éviter toute transformation. Ils sont analysés par microscope optique, par DSC et par diffraction aux rayons X sur poudres.
Cinq vitesses de refroidissement V ref sont testées pour cinq températures initiales Ti . L’analyse d’image des cristaux montrent trois types de formes: aiguille, bipyramide et une autre forme hybride aiguille/bipyramide (Figure 9).

Cristallisation par refroidissement couplée isotherme

L’objectif est de se placer à la limite de la courbe de sursaturation de la forme γ.Pour cela, il faut tout d’abord déterminer la sursaturation minimale. Les valeurs obtenues dans la figure 11 4 ont été utilisées pour tracer la courbe de la largeur métastable (∆T) en fonction de la vitesse de refroidissement (Figure 14).

CONCLUSION

Notre objectif est atteint. Nous avons pu obtenir 100 % de glycine α ou 100 % de glycine γ ensolution aqueuse en jouant sur les conditions opératoires. Ainsi, il est possible de définir les domaines de prédominance des deux formes polymorphiques. Ce diagramme est très utile lors de la conception d’une unité de cristallisation de polymorphes. En définissant ainsi les frontières de chaque forme, il est donc possible de mettre en œuvre une cristallisation sélective de l’une ou l’autre forme polymorphique.
Le tableau 9 donne les formes polymorphiques obtenues selon les conditions opératoires pour des cristallisations non amorcées.

CARACTERISATION ET ETUDE DE LA STABILITE

Le resvératrol utilisé dans cette étude est du trans- resvératrol pur à 99 % selon l’analyse GC (Sigma-Aldrich). Le cis-resvératrol n’étant pas disponible commercialement, nous avons irradié une solution de trans -resvératrol sous la lumière UV pour obtenir du cis-resvératrol. Mais comme l’isomérisation n’est pas complète avec cette méthode [Camont 2009], nous disposons d’un produit final à l’équilibre (après deux heures d’irradiation) qui est un mélange de ciset de trans -resvératrol. Le resvératrol qui nous intéresse est uniquement l’isomère trans et non le resvératrol total (cis+ trans ). Il faut donc trouver un moyen de quantifier séparément les deux isomères.
Pour quantifier le resvératrol, plusieurs méthodes ont été utilisées dans la littérature, comme le dosage enzymatique [Soleas 1997], les méthodes électrochimiques [Gu 2000; Arce 1998], la spectrométrie UV et les méthodes chromatographiquescouplées ou non[Camont 2009, Goldberg 1996, Trela 1996, Pascual-Marti 2001]. La chromatographie en phase gazeuse (CPG), couplée ou non avec la spectrométrie de masse constitue une méthode de dosage fréquemment utilisée pour la quantification du resvératrol. Elle a l’avantage deséparer et donc de distinguer l’isomère trans du cis [Soleas 1997]. Néanmoins, cette méthode est précédée de traitements chimiques [Luan 2000 ; Goldberg 1995]. La chromatographie liquide haute performance est également très utilisée et elle est plus appréciée que la CPG car elle est plus facile à mettre en place. De plus, il est désormais possible de faire une injection sans traitement préalable des échantillons chargés en différents types de solutés [Goldberg 1995 ; Shan 2008 ; Romero-Perez 2001 ; Todaro 2008 ; Tokusoglu 2005].

Caractérisation

Dans notre étude, deux méthodes ont été choisies pour leur facilité de mise en place et leur efficacité pour quantifier le resvératrol : la spectrométrie UV et la chromatographie liquide haute performance.

Dosage UV

Dans le cas du resvératrol, le dosage par spectrométrie UV est une méthode qui permet de suivre la transformation de la forme trans en fonction du temps. Les solutions à doser sont des solutions de resvératrol pur. Les spectres UV sont réalisés avec un spectromètre Perkin Elmer Lambda 25 qui effectue un balayageentre 1100 et 190 nm. Les données sont traitées avec le logiciel WinLab UV.
Des cuves en quartz (1 cm d’épaisseur) sont utilisées pour les mesures. L’échantillon de référence est le solvant utilisé pour dissoudre le resvératrol. Pour l’étude du pH, l’échantillon de référence est de l’eau distillée.
La figure 21 donne le spectre du trans -resvératrol ainsi que du mélange des isomères trans et cisresvératrol. Le spectre du trans -resvératrol présente une double bande caractéristique, le maximum d’absorption étant situé à 305 nm pour le trans- resvératrol. Des courbes d’étalonnage, en se plaçant à la longueur d’onde maximale de 305 nm du trans -resvératrol, sont tracées pour évaluer la quantité de trans -resvératrol resté en solution et de voir égalementla limite de concentration dosable aveccette méthode.
Pour les solutions irradiées, la présence du cis-resvératrol peut être détectée car des effets bathochrome et hypsochrome vers 290 nm ont lieu (Figure 21). Toutefois, le tracé d’une courbe d’étalonnage n’est pas possible parce que d’une part, les deux isomères ne sont pas correctement dissociés et d’autre part, il n’est pas possible d’affirmer que seul le cis-resvératrol se forme au cours de l’irradiation [Camont 2009 ; Trela 1996 ; López-Hernández 2007 ; Montsko 2008].

Dosage HPLC

La chromatographie liquide haute performance est une méthode très utilisée dans le dosage des composés d’origine végétale. La méthode de couplage est la plus précise et la plus rapide, mais l’installation est coûteuse. Or, pour les suivis systématiques, une méthode simple d’identification s’impose. Pour une molécule absorbant dans l’UV-visible, un étalonnage avec la molécule pure et un détecteur UV sont suffisants pour faire la quantification. Pour ces raisons, cette méthode est appliquée pour doser le resvératrol.
Les solutions de trans -resvératrol pur sont préparées pour l’étalonnage. Avant l’analyse, les solutions sont filtrées avec des filtres pour seringue à 0,45 µm de pore. Les analyses sont effectuées sur une colonne C18 Hypersil (250 × 4,6 mm, 5 µm), thermostatée à 35°C dans un four Thermasphere ® TS-130, reliée à une pompe Shimadzu LC-10 AD et un détecteur UV Shimadzu SPD-6A. L’élution est en mode isocratique avec un débit de 0,5 mL.min -1 . Un échantillonneur automatique Varian TM (modèle 400) assure l’injection d’échantillons. Levolume d’injection est de 10 µL. La longueur d’onde de détection est de 305 n m, longueur d’onde maximale du transresvératrol.
Pour l’étude du resvératrol en solution (solvants aqueux ou organiques), la procédure HPLC utilisée est basée sur les travaux de Camont et al . [Camont 2009]. Elle est développée afin de séparer les deux isomères ciset trans avec une analyse rapide. La phase mobile est un mélange méthanol/eau, 50/50 (v/v) acidifié avec de l’acide acétique à 0,5%. Dans ces conditions, le temps de rétention du trans -resvératrol est de 5,9 min (Figure 22).
Pour les solutions irradiées contenant les deux isomères trans et cis-resvératrol, un autre pic attribué au cis-resvératrol, avec un temps de rétention de 8 minutes, apparaît sur le chromatogramme (Figure 22).

Etude de la stabilité dutrans-resvératrol

Pour beaucoup de substances, les informations relatives à leurs stabilités ont été publiées dans la littérature. Dans le cas du trans -resvératrol, il a été démontré que ce composé est une molécule photosensible qu’une simple exposition à la lumière suffit à transformer en son isomère cis ; de plus, elle supporte mal la chaleur et les milieux oxydants [Bernard 2007; Montsko 2008 ; Goldberg 1995 ; Camont 2009 ; Jensen 2010 ; Trela 1996]. Toutefois, Bertelli et al. [Bertelli 1998] ont montré que le trans -resvératrol reste stable dans la peau de raisins même gardés dans de mauvaises conditions. Une étude menée par Prokop et al. [Prokop 2006] a aussi montré que le trans resvératrol reste stable dans les extraits végétauxissus de raisin. Par contre, Roldan et al. [Roldan 2010] ont montré que, lors de la préparation industrielle du vin, les différentes conditions de fermentation, de clarification, de stabilisation à froid, de filtration et surtout les agents biologiques ont une influence sur la teneur finale du resvératrol dans le vin. Kolouchová-Hanzlíková et al. [Kolouchová-Hanzlíková 2004]ont, de leur coté, montré que la teneur en resvératrol dans le vin rouge, lorsque la bouteille de vin est ouverte et exposée à la lumière pendant plusieurs jours, change selon la variété (Saint Lawrence, pinot noir, etc.), le lieu et l’année de production du vin. Par ailleurs, une étude menée par Jensen et al. [Jensen 2010] a montré que le trans -resvératrol sous forme solide est stable même sous rayonnement UV. Les différents auteurs présentent donc des résultats discordants sur la stabilité de cette molécule. Compte tenu de ces désaccords, cette étude a pour objectif d’étudier la stabilité du resvératrolafin de pouvoir maîtriser sa conservation sous la forme trans dans les diverses étapes des expériences lors de sa manipulation.
Les essais de stabilité ont pour objectif de fournir des données probantes sur la façon dont la qualité d’un composé varie en fonction du temps sous l’effet de divers paramètres, comme la température, le type de solvant, le pH de la solution, la pression et la lumière, permettant ainsi de définir les conditions de manipulation et de conservation et de déterminer la durée de validité des produits.
L’étude de stabilité des solutions de resvératrol est réalisée dans un bécher contenant 100 mL de la solution à 35 µmol.L -1 . Le trans -resvératrol est soluble dans l’éthanol et pratiquement insoluble dans l’eau [Sun 2007 a,b ]. Ainsi, pour assurer la dissolution du soluté danschaque solvant utilisé, une solution mère de trans -resvératrol (1,75 10 -3 mol.L -1 ) est d’abord préparée dans l’éthanol à 95 %.
Ensuite, cette solution (2 mL) est diluée dans le solvant étudié (98 mL) afin d’avoir la dissolution avec une quantité négligeable de l’éthanol dans le solvant. La concentration finale des solutions à analyser est de 35 µmol.L -1 .
Il est démontré que le trans -resvératrol est mieux conservé dans des solutions organiques ou dans des solutions aqueuses acides. Les résultats ont permis de spécifier la durée de stabilité du trans resvératrol qui est de quelques minutes en solutionbasiques, de 8 heures en solution aqueuse neutre, et de plus de 24 heures en solutions acides et organiques. Il est donc fortement recommandé de ne pas travailler en milieu basique et de ne pas dépasser une durée de 8 heures lors des manipulations en milieu aqueux neutre. Par ailleurs, une conservation à basse température est conseillée.
L’emballage de conservation doit être opaque à la lumière UV ou à défaut, il faut garder les solutions dans l’obscurité. Il est tout à fait possible de procéder à une distillation ou évaporation sous vide d’une solution contenant du trans -resvératrol sans dégrader ce dernier. Dans le vin, le trans -resvératrol reste stable pendant au moins 12 semaines en bouteille. Le vin contient en effet 12 % d’éthanol et dans ce type de solvant, nous avons montré que le trans resvératrol est stable. Par ailleurs, le vin a un pH acide situé aux environs de 3,5. Ceci peut également expliquer, entre autres, la stabilité du trans -resvératrol dans le vin. Lors de l’évaporation avec un évaporateur rotatif sous vide, le composé reste stable dans le vin, ainsi que lors des changements de température. Les conditions de stabilité du resvératrol étant connues, il est désormais possible d’entamer l’étude de l’extraction liquide-liquide. Les modes opératoires du procédé d’extraction doivent tenir compte des résultats obtenus précédemment pour s’assurer de ne pas dégrader le produit au cours des expériences.

EXTRACTION DU RESVERATROL

L’extraction liquide-liquide est largement utilisée dans des domaines aussi variés que l’industrie pharmaceutique et agroalimentaire, l’hydrométallurgie, l’industrie nucléaire, la pétrochimie, etc. Il s’agit d’une technique de séparation qui consiste en un transfert de matière entre deux phases liquides non ou partiellement miscibles.
Deux modes d’extraction existent : l’extraction continue et l’extraction discontinue. Mais le phénomène général de l’opération est le même puisqu’une extraction continue est une succession d’extractions en discontinu. Les termes utilisés pour l’extraction liquide-liquide ont une nomenclature normée [Rice 1993]. Il faut ainsi définir certains termes que nous allons utiliser au cours de cette étude.
Le solvantest le liquide d’extraction. Il sert à extraire les solutés de la solution d’alimentationpour donner un extrait et laisse une solution raffinée appelé raffinat. Le solvant est en général l’extractant, c’est-à-dire le composé actif du solvantet principal responsable du transfert d’un ou plusieurs solutés d’une phase à l’autre. Mais, il arrive parfois que le solvant soit composé d’un extractantet d’un diluant. Le diluantest un liquide ou mélange de liquides dans lequel,l’extractant est dissous [Cote 1998].
Pour un soluté considéré, un couple de deux phases permet de réaliser une séparation vis-à-vis des impuretés indésirables grâce à des solubilités différentielles. Il faut donc choisir deux phases de nature différente. Cependant, la nature de l’une des phases est le plus souvent imposée, comme dans notre cas, il s’agit de la phase d’alimentation, cequi contraint à optimiser uniquement le choix de la seconde phase qui joue alors le rôle de solvant. La recherche d’un solvant d’extraction constitue alors une étape importante en extraction liquide-liquide.

Méthodes – Recherche d ’un solvant

Un bon procédé d’extraction exige une installation économique, fiable, compacte et efficace. Pour satisfaire à ces exigences, le choix du solvant est primordial et très complexe. En réalité, il est impossible de trouver un solvant idéal. Il faut donc trouver le meilleur compromis. Certaines de ces caractéristiques peuvent être évaluées en amont de l’extraction, comme la stabilité chimique, les caractéristiques physico-chimiques (volatilité, viscosité et densité) ainsi que les propriétés économique et toxiques du produit. D’autres caractéristiques ne peuvent être évaluées qu’après extraction comme la sélectivité, la capacité d’extraction et les propriétés favorables à la cinétique.
Ces propriétés seront donc considérées comme des réponses.
Dans cette étude, la sélectivité et le rendement sont étudiés pour évaluer l’efficacité de l’extraction.
L’objectif est de minimiser le transfert des impuretés et de maximiser le rendement en resvératrol.
Le solvant du vin est partiellement réduit (réduction à 1/7ème du volume initial) par évaporation sous vide pour obtenir un vin concentré afin de s’approcher de la composition du résidu de distillation des eaux de vie. Le tout est placé dans des flacons au réfrigérateur et cela pendant 3 jours avant d’effectuer toute manipulation. En effet, une décantation d’une matière solide au fond du récipient a pu être observée. Ce solide décanté est insoluble dans l’eau et dans le méthanol, mais soluble dans l’éthanol. Les analyses de cette solution montrent que le resvératrol n’y est pas présent.
Cette solution de vin concentrée va servir de solution d’alimentation pour les expériences.

Table des matières

Introduction 
Première partie : Cristallisation
I. Etude préliminaire – Conséquences du polymorphisme sur les propriétés physico-chimiques
II. Contexte et objectif
III. Méthode
IV . Résultats
IV.1. Cristallisation isotherme (semi-continue)
IV.2. Cristallisation par refroidissement
IV.3. Cristallisation par refroidissement couplée isotherme
IV.4. Cristallisation avec ensemencement
IV.5. Estimation des vitesses de croissance des polymorphes
V . Conclusion
Deuxième partie : Extraction liquide-liquide
I. Contexte et objectif
II. Caractérisation et étude de la stabilité
II.1. Caractérisation
II.2. Etude de la stabilité du trans-resvératrol
III. Extraction du resvératrol
III.1. Méthodes – Recherche d’un solvant
III.2. Résultats et discussions
IV . Conclusion
Troisième partie : Adsorption
I. Contex te et objectif
II. Méthode
II.1. Choix de l’adsorbant
II.2. Adsorption-désorption du resvératrol sur du nylon
III. Résultats
III.1. Etude avec des solutions étalons
III.2. Application de l’adsorption – désorption pour l’extraction et la purification du resvératrol du vin
IV . Conclusion
Conclusion générale
Références bibliographiques