Conditions d’élevage des escargots en laboratoire et obtention des pontes

L’élevage des escargots est maîtrisé en laboratoire (Gomot et Deray, 1987 ; Gomot, 1997 ; Gomot de Vaufleury, 2000 ; ISO 15952:2006). Les escargots matures pour la reproduction proviennent de l’élevage interne du laboratoire en parc extérieur de mai à octobre puis ils sont utilisés, selon leur date de récolte, soit directement pour obtenir des pontes, soit après quelques mois d’hibernation (ISO 15952:2006). Les adultes reproducteurs sont placés dans des cages (40 individus par m2) dans une salle régulée avec une photopériode de 18 heures de lumière par jour, une température de 20°C et une humidité d’environ 80% (Figure II-1). Les cages sont nettoyées 3 fois par semaine. Les adultes sont nourris avec un aliment pour escargots Helixal® unique (SAS Antigny Nutrition, 85510 Le Boupere). Une semaine à 10 jours après avoir observé des accouplements, des pots de ponte (récipients en verre remplis de terreau horticole SEM support de culture NF 44-551, avec engrais ; 82% de matière organique, pH : 6,5) sont placés dans les cellules du dispositif d’élevage en fin de journée. Le lendemain matin, les escargots en cours de ponte (Figure II-2) sont isolés. Une fois la ponte terminée, l’escargot est replacé dans sa cellule et les œufs sont nettoyés à l’aide d’une passoire dans une bassine d’eau à 20°C afin de retirer le maximum de particules de terreau. Ils sont ensuite comptés et déposés dans une boîte de Pétri (Stérilin, 90 x 14,2 mm, polystyrène cristal, 3 ergots) contenant du papier Whatman humidifié (grade I, diamètre 90 mm) jusqu’à leur utilisation ou leur éclosion.

Le bioessai en phase liquide (LPB – Liquide Phase Bioessai) mis au point par Druart et al. (2010, 2012) a été utilisé pour toutes les expositions aux substances chimiques réalisées au cours de ce travail de thèse. Une fois nettoyés, les oeufs sont exposés dès les premiers stades de l’embryogenèse 12 à 24h maximum après la fin de la ponte. Généralement 3 à 5 pontes (réplicats) par essai sont utilisées. Les œufs d’une même ponte sont déposés à raison de 10 par réplicat, dans des boîtes de Pétri (Greiner Bio-one, 35 x 10 mm, polystyrène cristal, 3 ergots), dont le fond est recouvert par 4 papiers filtres (Whatman grade 1 ; 32 mm de diamètre). Les papiers filtres sont ensuite imbibés de 0,8 mL de solution à tester ou d’eau déminéralisée pour la modalité témoin (Figure II-3). Sigma chemical, 99,99%), de poudre de Bouillie Bordelaise RSR Disperss (20% de Cu, Cerexagri), ou de solution commerciale de Round Up® flash (glyphosate 450 g/L, Monsanto) ou Corail® (tébuconazole 250 g/L, Bayer Cropsciences). Toutes les solutions sont préparées  En fin d’exposition, généralement après 20 jours afin de prendre en compte les éventuels retards d’éclosion chez les œufs/embryons exposés aux contaminants, le pourcentage d’éclosion est déterminé ainsi que les paramètres écotoxicologiques courants, comme les Concentrations Efficaces inhibant 10 et 50% du succès d’éclosion (CE10 et CE50).

 Exposition continue Cette 1ère modalité permet d’étudier les effets d’une exposition telle qu’elle peut se produire en milieu naturel quand l’humidité du sol est constante et que la solution du sol présente une concentration stable d’un contaminant non dégradable (métaux par exemple). Pour les molécules organiques moins rémanentes, ce scénario permet de prendre en compte leur dégradation dans le milieu au cours de l’exposition. En exposition continue, les œufs sont incubés dans des boîtes de Pétri dont le fond est recouvert de papiers filtres imbibés de solutions contaminées sans renouvellement des papiers filtres au cours du bioessai. Le jour d’exposition au contaminant est appelé jour 0.Ce type de scénario mime une exposition se déroulant en milieu naturel avec une période d’exposition puis un lessivage des contaminants après une pluie par exemple. Dans ce scénario, la durée de l’exposition aux contaminants est fixe (24 h). Après cette étape, les œufs sont transférés sur du papier humidifié non contaminé. Ce type d’exposition a été utilisé afin d’étudier la régulation des gènes des MTs chez les embryons qui ont été exposés à deux stades : 0 et 6 jours (Figure II-4). Après la fin de la ponte les œufs sont rapidement séparés en 2 groupes. Une partie est incubée avec les contaminants pour une durée de 24 heures (du jour 0 au jour 1) puis les œufs sont placés en conditions témoins jusqu’à l’éclosion (J1 à J20). Le reste de la ponte est incubée en conditions témoins (0,8 mL d’eau osmosée) jusqu’au 6ème jour de développement (début du stade larvaire) avant d’être exposé pendant 24 heures, c’est-à-dire jusqu’au jour 7. Les œufs sont ensuite incubés en conditions témoins jusqu’à l’éclosion (J7 à J20).