CO – CONCEPTION POUR LA DÉTECTION DE MOLÉCULES UNIQUES

Nous avons optimisé des masques de phase binaires annulaires pour étendre la profon- deur de champ des techniques SMLM. Ces masques modifient la réponse impulsionnelle du système d’imagerie pour rendre la précision de localisation transverse d’un marqueur fluorescent la plus invariante possible le long de l’axe optique. Ils permettent ainsi d’amé- liorer la localisation dans un volume imagé au prix d’une perte raisonnable de précision dans le plan focal. Cependant, le traitement numérique d’une image acquise se compose de deux étapes suc- cessives : la « pré-localisation » (ou « détection »), où l’on détermine les régions de l’image dans lesquelles se trouvent des fluorophores, et la localisation sous-pixellique des fluoro- phores dans chacune de ces régions. Or, la présence d’un masque de phase dans la pu- pille du microscope conduit à un étalement de la PSF, qui peut affecter l’étape de pré- localisation. Il est donc nécessaire d’évaluer l’effet que peut avoir un masque de phase sur l’étape de pré-localisation, et de proposer le cas échéant une méthode d’optimisation des masques réalisant un compromis entre probabilité de détection et précision de localisa- tion. une configuration expérimentale adaptée, la précision de localisation de l’estimateur du MV est entièrement caractérisée par la BCR. En plaçant dans la pupille de l’objectif un masque de phase binaire annulaire optimisé selon ce critère, il est possible de modifier la réponse impulsionnelle du système d’imagerie afin d’étendre la PdC des techniques SMLM.

Cependant, le traitement numérique complet d’une image se compose de deux éta- pes successives. La première, nommée « pré-localisation » ou « détection », consiste à déterminer grossièrement la position des régions de l’image dans lesquelles se trouve un fluorophore. La seconde étape consiste à localiser le fluorophore, dans chacune des régions pré-détectées, avec une précision sous-pixellique (bien inférieure à la limite de diffraction) en utilisant les algorithmes décrits dans les chapitres 3 et 4. Les masques de phase binaires annulaires déterminés dans les chapitres précédents ont été optimisés uniquement pour cette seconde étape : ils permettent de maximi- ser la précision de super-localisation d’un marqueur fluorescent sur une plage de PdC étendue. Or on ignore l’influence que peuvent avoir ces masques sur l’étape de pré- localisation. L’objectif de ce chapitre est de répondre à cette question. Pour cela, nous allons tout d’abord construire un critère basé sur la distance de Bhattacharyya pour dis- criminer un fluorophore du fond diffus. Nous utiliserons ensuite ce critère pour optimi- ser des masques de phase binaires annulaires adaptés à la détection. Nous comparerons enfin les masques obtenus à ceux optimisés précédemment pour la localisation, afin de déterminer s’il existe des masques efficaces à la fois pour la détection et la localisation. L’étape de pré-localisation (ou de détection) de marqueurs fluorescents peut être formulée comme un problème de classification, où l’on distingue automatiquement les données acquises selon qu’elles contiennent l’image d’un fluorophore ou qu’elles n’en contiennent pas. Pour évaluer la difficulté de ce problème de classification, nous pro- posons dans cette section d’utiliser la distance de Bhattacharyyagrille de pixels et évaluée au pixel (i , j ). Elle est définie à l’Équation (3.5). Les paramètres à et µ sont supposés connus.

Pour illustrer ces deux hypothèses, nous avons simulé en Figure 6.1 un ensemble d’acquisitions pour lesquelles l’image d’un fluorophore est soit absente (comme illustré à la Figure 6.1(a)), soit présente (comme illustré aux Figures 6.1(b-d)). La Figure 6.1(e) représente l’histogramme de la valeur du pixel central construit à partir de 8000 réa- lisations différentes de bruit. Ces simulations numériques sont réalisées avec les para- mètres décrits dans le Tableau 5.1 et pour trois valeurs du paramètre de défocalisation Ã, à savoir Ã Æ {0;0,25¸;0,5¸}. Comme nous l’avions mis en évidence au Chapitre 3, on 2 en distinguant celles contenant un signal de fluorescence (i.e., celles vérifiant l’Hypothèse H1) et celles n’en contenant pas (i.e., celles vérifiant l’Hypothèse H0). Cette classification est communément appelée un « test d’hypothèses ». Neyman et al. [1933] ont montré que l’algorithme optimal, i.e., le plus efficace, consiste à comparer le rapport de vraisemblance à un seuil., et n’a pas de forme analytique. Cependant, Jain et al. [2002] ont montré que pour de nombreuses applications, la valeur optimale de ° est proche de 1/2. C’est d’ailleurs ce que l’on observe à la Figure 6.2 où la valeur optimale du paramètre ° est représentée en fonction du paramètre de défocalisation à : la somme des distances de Chernoff atteint son maximum pour une valeur de ° proche de 1/2.