Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC)

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Discussion générale

Ces travaux de thèse ont pour objectif d’identifier de nouvelles molécules antibactériennes pour une utilisation en écloserie. L’alternative aux antibiotiques proposée doit être compatible avec les conditions d’utilisation comme la forte salinité qui peut altérer l’activité antibactérienne (Lee et al. 1997). La solution proposée doit par ailleurs être respectueuse de l’environnement afin d’être en accord avec la politique de l’entreprise. Notre stratégie de recherche repose sur l’identification de peptides antimicrobiens chez deux organismes marins. Le premier, le poisson-lion, Pterois volitans est un poisson Téléostéens venimeux originaire de l’Indopacifique. Le second, la seiche, Sepia officinalis est un Mollusque Céphalopode qui vit sur les côtes de la Manche.
Beaucoup de caractéristiques opposent ces deux modèles : vertébrés/invertébrés, invasif/endémique, itéropare/semelpare … mais finalement l’ensemble de ces différences a accentué notre intérêt pour ces deux modèles dont aucun PAM n’avait été identifié auparavant. Nous n’avons pas exploré le modèle de l’huître pour rechercher des PAMs, pour deux raisons, d’une part beaucoup d’entre eux ont déjà été caractérisés (Schmitt et al. 2012) et d’autre part, les mécanismes de résistance de Vibrio splendidus face à la Cgdef et la Cg-BPI de l’huître (Duperthuy et al. 2010), nous ont conduits à réaliser nos recherches chez d’autres organismes.
A l’ère du développement des nouvelles technologies de séquençage et d’informatique, la recherche de molécules dans le domaine de la biologie a fait un réel bon en avant et particulièrement dans le champ des PAMs. Nous avons désormais accès à diverses bases de données regroupant les PAMs (Gueguen et al. 2006; Wang et al. 2016), à des logiciels de recherche de motifs de familles de PAMs (Waghu et al. 2016), à des utilitaires d’alignements comme BLAST et à bien d’autres outils… Avec ces progrès, les stratégies de recherche de PAMs ont aussi évolué. A l’aide de ces outils nous avons pu explorer les bases de données transcriptomiques du poisson-lion et de la seiche. Ces travaux témoignent du succès rencontré à travers l’approche in silico menée pour identifier de nouveaux antibactériens et montre l’étendue de ce champ de recherche. D’un côté, nous avons été en mesure à partir d’un transcriptome de novo unique et ciblé d’identifier sur la base d’homologies de séquences les 7 premiers précurseurs codants pour des PAMs chez le poisson-lion. Il n’y a pas d’étude qui fait état de l’identification de l’ensemble des familles de PAMs chez un téléostéen par cette approche. Si cette stratégie s’est révélée très efficace pour le poisson-lion, elle fut infructueuse pour la seiche et cela malgré les différents transcriptomes étudiés. Il est vrai que chez les Téléostéens, les différentes familles de PAMs sont bien décrites (Masso-Silva and Diamond 2014). Pour la seiche qui apparait comme un modèle de plus en plus atypique, les approches classiques ne sont pas non plus concluantes. La stratégie de recherche d’antibactériens menée dans cette étude à partir de caractères physico-chimiques et de motifs structuraux est une bonne alternative. Nous montrons ici que le « design » de PAMs est possible et que des travaux complémentaires pourraient permettre de confirmer l’existence d’au moins l’un d’entre eux. Cette étude avec celle de Fedders et Leippe (2008) montrent que la recherche in silico n’est pas uniquement destinée à la recherche de PAMs conservés comme cela avait pu être évoqué (Sperstad et al. 2011). En réalité cette approche présente plusieurs avantages : sa rapidité vis-à-vis de la purification de peptides bioactifs qui nécessite du temps et du matériel biologique. Elle s’inscrit par ailleurs dans une démarche plus responsable en réduisant drastiquement la quantité de matériel biologique. Enfin, elle se présente comme une alternative lorsque les réglementations sur les expérimentations animales sont strictes
ou qu’elles incluent d’autres animaux que les vertébrés comme les Céphalopodes. Notre stratégie repose par ailleurs sur le développement de peptides de petite taille et de structure simple. L’objectif est d’une part, de réduire le coût d’utilisation mais surtout d’éviter les problèmes associés à la structure tertiaire. La formation de ponts disulfures par la présence de cystéines est essentielle pour l’activité de la défensine hBD-1 (Schroeder et al. 2011) ou de l’hepcidine chez l’homme (Hocquellet et al. 2012). Nous nous sommes donc focalisés sur des peptides linéaires de petite taille qui peuvent se structurer en hélice-a. Avec cette étude nous avons exploré davantage le champ des piscidines à travers l’étude des pteroicidines A, B et C identifiées chez le poisson-lion.
Nous avons d’une part démontré qu’une piscidine peut être présente sous les deux formes amidée et non amidée comme cela avait été observé pour la moronecidine (ou piscidine1) (Silphaduang and Noga 2001). Par ailleurs, l’étude comparée des deux formes de l’a- Pte montre que l’amidation joue un rôle crucial dans la structuration en hélice, l’activité antibactérienne et l’hémolyse. Nos résultats sont différents de ceux obtenus par Chekmenev et collaborateurs (2006) qui concluent que l’amidation n’influence pas l’activité des piscidines 1 ou 3. Ils sont toutefois en accord avec d’autres études démontrant que l’amidation augmente l’activité biologique (Strandberg et al. 2007;
Dennison et al. 2009; Dennison and Phoenix 2011) ou la stabilisation de l’hélice-α (Mura et al. 2016) comme nous l’avons observé avec la a-Pte. L’étude complémentaire des peptides g-Pte et b-Pte montre que les peptides formés par les 20 premiers acides aminées des précurseurs des pteroicidines B et C sont de très bon antibactériens. D’autres études de piscidines font état d’observations semblables. Chez le tilapia, Oreochromis niloticus, les piscidines TP3 et TP4 de longueurs respectives 23 et 25 résidus, sont actifs sur des bactéries à gram-positif et gram-négatif (Peng et al. 2012) (à des concentrations inférieures à 8 μg/mL pour TP4 et 20 μg/mL pour TP3). Néanmoins, leur forme endogène n’a pas été confirmée (Peng et al. 2012). En parallèle, les formes TP1, TP2 et TP5 ne sont pas antimicrobiens. Un autre exemple avec la chionodracine, une piscidine potentiel de 22 aa chez le poisson des glaces, Chionodraco hamatus, elle est antibactérienne sur E.coli à 5μM ou Bacillus cereus à 10 μM (Buonocore et al. 2012). De nombreux autres exemples de piscidines antibactériennes dont les séquences n’ont pas été confirmées in vivo ont été répertoriés dans le tableau 7. Par ailleurs, la longueur des pteroicidines b et g est importante. Avec les 17 premiers résidus les peptides sont encore actifs, mais plus la taille est réduite et moins les peptides sont antibactériens. Cela suggère que la taille des piscidines est importante tout comme la région C-terminale puisqu’en la supprimant il y a une perte d’activité. En effet, alors que les peptides FI16 et FK19 (issus de la seiche) partagent de fortes homologies de séquences du côté N-terminal avec d’autres piscidines (Figure 46), ils ne sont pas de bons antibactériens. Ces résultats semblent indiquer que la région C-terminale est déterminante pour l’activité antibactérienne. Le caractère amphiphile des piscidines avec une région N-terminale hydrophobe incluant des phénylalanines isoleucines ethistidines et une région C-terminale cationique avec une répartition adéquate des lysines et/ou arginines sont à l’origine de leur activité
antibactérienne. L’étude de Lee et collaborateurs (2007) sur la piscidine 1 est en accord avec cette hypothèse. Par ailleurs, concernant les TP1, TP2 et TP5, les piscidines du tilapia évoquées précédemment, elles n’ont pas la signature en phénylalanine, isoleucine et histidine du côté N-terminal contrairement aux TP3 et TP4 (Peng et al. 2012). Et malgré une région C-terminale chargée positivement, elles ne sont ni hémolytiques, ni antivirales, ni antibactériennes (Peng et al. 2012). Ensemble ces données tendent à montrer que les piscidines interagissent avec la membrane par des interactions électrostatiques dans un premier temps, puis que la région hydrophobe perfore la membrane bi-lipidique. En somme, une taille minimum et le caractère amphipathique sont indispensables pour l’activité antibactérienne.
Finalement, au travers de cette étude et parmi les peptides étudiés, tous ne se sont pas montrés antibactériens. Par exemple VA20 est hémolytique, GK16, KY15 et WK20 sont antibactériens, FK19 est hémolytique et antibactérien et d’autres sont algicides et antibactériens comme GR21 et K4. Ces résultats mettent en lumière l’aspect multifonctionnel des peptides antimicrobiens comme cela a été décrit notamment.

Table des matières

A. Contexte de la thèse
B. L’objectif de la thèse
Introduction générale
A. Présentation de l’huître creuse, Magallana gigas
1. Généralités
1.1. Classification
1.2. Quelques généralités & Cycle de vie de l’huître
2. Pathogènes de l’huître et alternatives
2.1. Les virus
2.2. Les Vibrios
2.3. Système immunitaire de l’huître
2.4. Quels sont les alternatives permettant de lutter face aux infections en aquaculture et
notamment en écloserie ?
B. Les peptides Antimicrobiens
1. Historique et présentation générale
1.1. Les Bases de données dédiées aux peptides antimicrobiens
1.2. Qu’est-ce qu’un Peptide Antimicrobien ?
Les peptides antimicrobiens à hélice-ɑ
Les peptides antimicrobiens riches en cystéines
Les peptides antimicrobiens riches en certains acides aminés
Les peptides antimicrobiens plus atypiques
1.3. Les différents modes d’actions des peptides antimicrobiens
le modèle « des pores en douves de tonneaux »
Le modèle « des pores toroïdaux »
Le modèle « en tapis »
1.4. Les mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens
Chapitre I : Identification de PAMs chez le poisson-lion, Pterois volitans
A. Introduction
1. Présentation du modèle Pterois volitans
1.1. Classification
1.2. Mode de vie
1.3. Cycle de vie
1.4. Le poisson-lion : une espèce invasive
1.5. Connaissance immunité et les maladies associées
2. Système immunitaire des poissons téléostéens
2.1. La peau des poissons
3. Objectifs
B. Les PAMs riches en cystéines chez les poissons
1. Etat de l’art
2. Les PAMs riches en cystéines identifiés chez le poisson venimeux, Pterois volitans.
3. Conclusion: PAMs riches en cystéines
C. Les PAMs spécifiques des poissons : Les piscidines
1. État de l’art
2. Identification d’un peptide antimicrobien, une « moronecidine-like » chez le poisson venimeux
Pterois volitans : étude fonctionnelle et structurale de la pteroicidine-α.
3. Identification de deux nouveaux précurseurs apparentés aux piscidines chez le poisson-lion,
Pterois volitans : les pteroicidines B et C
3.1. Introduction
3.2. Matériels et méthodes
2.2.1 Matériel biologique
2.2.2 Analyse in silico du transcriptome de Pterois volitans
2.2.3 Recherche des formes matures des pteroicidines β et γ.
2.2.4 Sélection et synthèse des peptides à partir des pteroicidines B et C
2.2.5 Tests antibactériens
2.2.6 Tests hémolytiques
2.2.7 Etude structurale par dichroïsme circulaire
3.3. Résultats et discussion
3.4. Conclusion
4. Discussion pteroicidines
D. Discussion
Chapitre II : Identification de PAMs chez la seiche, Sepia officinalis
A. Introduction
1. Présentation du modèle Sepia officinalis
1.1. Classification
1.2. Caractéristiques et mode de vie
1.3. Cycle de vie de la seiche : une espèce migratrice et semelpare
2. Les Céphalopodes face aux infections
2.1. Etat de l’art sur les maladies décrites chez les céphalopodes
2.2. Le système immunitaire chez les céphalopodes
2.3. La peau chez les céphalopodes
3. Les Objectifs
B. Recherche de peptides antimicrobiens au niveau de la peau
1. Introduction
2. Matériel et méthodes
2.1. Matériel biologique
2.2. Extraction peptidique
2.3. Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC)
2.4. Test Antibactérien
2.5. Réduction, alkylation et digestion trypsique
2.6. Séparation en Nano-LC (Liquid-Chromatography)
2.7. Analyse en spectrométrie de masse
2.8. Traitement Bio-informatique
3. Résultats
4. Discussion
C. Recherche de PAMs chez Sepia officinalis : étude in silico
1. Introduction
2. Méthode
3. Résultats
3.1. « Design » de Peptides antimicrobiens chez Sepia officinalis
3.2. Résultats des peptides WK20, KY15, GK16
D. Discussion
Chapitre III : Transfert des PAMs en aquaculture et plus particulièrement en écloserie
A. Introduction
1. L’aquaculture
2. Les problèmes liés l’aquaculture
2.1. Les antibiotiques
2.2. Le potentiel des peptides antimicrobiens en Aquaculture
3. Objectifs
B. Etude du peptide K4 en milieu marin
C. Vers un transfert de PAMs en écloserie
1. Introduction
1.1. La SATMAR
1.2. Le site d’accueil de la SATMAR
1.3. Le parcours Zootechnique
1.4. Transfert de PAMs en écloserie
2. Approche méthodologique
2.1. Peptides candidats
2.2. Innocuité des peptides candidats sur du naissain d’huîtres
2.3. Innocuité des peptides candidats sur des microalgues utilisées en écloserie d’huîtres
2.4. Innocuité des peptides candidats sur des larves d’huître
3. Résultats
4. Discussion
D. Conclusion
Discussion générale
Perspectives
Bibliographie
Annexes