Chimiosensibilité en vivo des souches de Plasmodium falciparum

Vecteurs et transmission du paludisme

Selon Pages et al, (Pages et al., 2007), un vecteur n’est pas simplement une seringue récupérant un agent pathogène chez un hôte pour l’injecter à un autre. C’est un point de passage obligatoire pour la diffusion de l’agent pathogène qui va soit simplement s’y multiplier (virus) ou y assurer une part de son cycle (parasites). Pour le paludisme, le genre Anopheles constitue l’unique vecteur du parasite. Les anophèles appartiennent à l’embranchement des Arthropodes, à la classe des Insectes, à l’ordre des Diptères, au sous-ordre des Nématocères et à la grande famille des Culcidae, à la sous-famille des Anophelinae et au genre Anopheles. Au Sénégal, la faune anophélienne compte une vingtaine d’espèces et parmi celles-ci, seulement les complexes A. gambiae, A. arabiensis et A. funestus sont impliqués dans la transmission du paludisme (Diagne et al.., 1994). Cette dernière se fait par le biais d’une piqûre infectante d’un anophèle femelle, hématophage, lors de son repas sanguin. La transmission se fait généralement après le coucher du soleil. Cependant, depuis l’instauration des MILDA, il a été noté que les anophèles piquaient entre 5 heures et 6 heures du matin (Moiroux et al., 2012). Cette transmission est favorisée par des facteurs climatiques (température, humidité, eau, …), anthropiques (urbanisation, réseau démographique, …) et socio-économiques.
Il existe d’autres modes de contaminations souvent accidentelles par transfusion sanguine, par voie placentaire, ou encore par accident au laboratoire.

Clinique du paludisme

Les manifestations cliniques du paludisme sont très diverses dans leur expression et dans leur gravité, notamment selon l’espèce plasmodiale en cause. Pour P. falciparum qui est l’espèce la plus pathogène, les accès « simples »(sans complications) peuvent s’exprimer par une fièvre de 39°- 40°, des frissons, sueurs accompagnées de céphalées, de vomissements et d’une splénomégalie parfois d’une hépatomégalie (Soulama, 2010). Un diagnostic précoce permet alors d’instituer un traitement et d’éviter l’évolution vers un paludisme grave. Les trois complications majeures d’un accès à P. falciparum sont l’anémie grave, un syndrome de détresse respiratoire et le neuropaludisme. Cependant, il existe un paludisme asymptomatique c’est-à-dire absence de manifestations cliniques chez un individu présentant des formes asexuées du parasite à l’examen microscopique du sang périphérique.

Les méthodes de diagnostic directes

La Goutte Epaisse (GE) et le Frottis Mince (FM) : Cette méthode consiste à mettre sur une même lame deux gouttes de sang capillaire provenant d’un doigt. La GE défibrinée et le FM étalé en une couche monocellulaire fixée au méthanol sont colorés au Giemsa ou au May-Grunwald Giemsa. La lecture de la lame effectuée au microscope optique à l’objectif 100 avec de l’huile d’immersion permet de poser le diagnostic et en cas de positivité d’évaluer la densité parasitaire pour la GE et de déterminer l’espèce plasmodiale à partir du frottis . La sensibilité d’une GE est de 6 parasites/μl de sang et celle du FM est de 100 parasites/μl de sang (Gentile et Geneviève, 2000 ; Delaunay et al., 2008). C’est la méthode de référence de l’OMS et elle nécessite une expertise.
Tests de diagnostic rapide (TDR) : Ces tests se présentent sous forme de cassette et sont basés sur la détection du lactate déshydrogénase (LDH) qui est une enzyme commune aux quatre espèces mais plus générée par P. falciparum et l’Histidine rich protein (HRP 2) spécifique à P. falciparum. Ils permettent une détection rapide de la présence du parasite par simple observation de la cassette et ont une sensibilité de 96% (Munier et al., 2009). Cependant, ils ne permettent pas une détermination de la densité parasitaire et certains d’entre eux présentent des problèmes de sensibilité et de spécificité.
Quantitative Buffy Coat (QBC) : Elle consiste à récupérer l’interface entre le sérum et le culot de globules rouges après centrifugation d’un prélèvement de sang veineux sur EDTA. L’interface censée contenir les parasites est colorée par l’acridine orange qui se fixe à l’ADN parasitaire et émet une fluorescence. La lecture effectuée au microscope à fluorescence présente l’ADN sous forme de taches brillantes. Cette technique est couteuse et ne permet pas l’identification des espèces même si elle présente une sensibilité de 97,77% (Vaidya et Sukesh, 2012).
Méthodes moléculaires : PCR et Illumigen Malaria LAMP
PCR : Elle permet d’amplifier de petites portions du génome parasitaire pour une identification des espèces plasmodiales. Elle peut détecter de faibles parasitémies de l’ordre de 0,3 parasite/µl de sang (Hänsheid et Grobusch., 2002). Elle est plus sensible que la microscopie mais elle est plus couteuse et nécessite un laboratoire spécialisé.
Illumigene Malaria LAMP : illumigene Malaria est un test de diagnostic qui s’appuie sur la technologie Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Il amplifie l’ADN et détecte la présence du parasite du paludisme avec une sensibilité de 100% (Lucchi et al., 2016). La technologie est simple, précise et facile à utiliser.

Méthodes de lutte contre le paludisme

Prophylaxie : Lutte antivectorielle
Elle consiste à mettre en place des mesures qui protègent contre l’infection palustre. Cette lutte peut se faire aussi bien au niveau individuel que collectif.
Prophylaxie individuelle : L’utilisation des MILDA doit être permanente et le port de vêtements de protection ainsi que l’utilisation de répulsifs et des poses d’écran anti moustiques sur les ouvertures des habitations sont préconisées.
Prophylaxie collective : Les eaux de surface doivent être traitées avec des larvicides pour éviter les gîtes larvaires et une pulvérisation intra-domiciliaire des habitations doit être effectuée en utilisant des insecticides à effet rémanent.
Chimioprévention : De nos jours, la chimioprévention ne se limite pas seulement aux femmes enceintes car un traitement antipaludique est aussi appliqué aux enfants pendant la saison de haute transmission. Chimioprévention du paludisme saisonnier : Elle est définie comme étant l’administration intermittente d’un traitement complet par un médicament antipaludique pendant la saison de haute transmission du paludisme. L’objectif est de maintenir des concentrations d’antipaludiques dans le sang pendant la période où le risque de contracter le paludisme est plus élevé. Un cycle de traitement complet par de la sulfadoxine-pyriméthamine (SP) et de l’amodiaquine (AMQ) doit être administré aux enfants âgés de 3 à 59 mois à intervalles d’un mois, à partir du début de la saison de transmission, jusqu’à un maximum de quatre cycles pendant la saison (OMS, 2013). Traitement préventif intermittent lors de la grossesse (TPIg) : Le TPIg recommandé pour toutes les femmes enceintes est composé de 4 doses de sulfadoxine/pyriméthamine. Dès la perception des premiers mouvements, la première dose estprise et les doses doivent être administrées au moins d’un mois d’intervalle. Toutefois, la dernière dose de TPIg peut être administrée jusqu’au moment de l’accouchement sans que cela ne représente un problème de santé (OMS, 2014).
Traitement : Après confirmation de l’infestation palustre par un diagnostic biologique, la prise en charge se doit d’être rapide et efficace. C’est ainsi que l’OMS a recommandé des antipaludiques aussi bien pour le paludisme simple que pour le paludisme grave.
Classification des antipaludiques : Les schizonticides
Cette classe d’antipaludiques regroupe les molécules qui par divers mécanismes tuent les parasites au stade de schizontes sanguins. Ils sont scindés en trois groupes.
Les schizonticides naturels : Dans ce groupe, nous avons les molécules d’antipaludique issues des plantes. Ces molécules sont : la quinine qui agit en inhibant la digestion de l’hémoglobine dans la vacuole nutritive et l’artémisinine et ses dérivés (l’arthéméter, l’artésunate et la dihydroartémisinine) qui agissent en produisant des radicaux libres par l’alkylation des métabolites de l’hémoglobine. Les schizonticides de synthèse : Ce groupe renferme les 4-amino-quinolèines (chloroquine, amodiaquine), les acyl-amino-alcools (méfloquine et halofantrine) et les antimétabolites (les antifoliniques comme pyriméthamine et proguanil et les antifoliques comme sulfadoxine, sulfaméthoxypyrazine et sulfone).
Les associations de schizonticides : les CTA : Ce sont des associations d’un dérivé d’artémisinine et un autre schizonticide. Ces associations peuvent être de deux ou trois molécules antipaludiques. Les gamétocytocides : Les molécules de cette classe détruisent les gamétocytes présents dans le sang et ainsi elles limitent la transmission de l’infection palustre. Cette classe regroupe les 8 amino-quinolèines (primaquine).
Les antibiotiques : Ils regroupent les tétracyclines et les macrolides qui inhibent certaines fonctions de l’apicoplaste en agissant sur la synthèse protéique.
Traitement du paludisme simple : Depuis 2001, l’OMS a recommandé l’utilisation des combinaisons thérapeutiques à base d’Artémisinine (OMS, 2001). Ces combinaisons sont : Artémether + Luméfantrine; Artésunate + Amodiaquine; Artésunate + Méfloquine; Dihydroartémisinine + pipéraquine; Artésunate + Sulfadoxine + Pyriméthamine.
Le traitement à base d’artémisinine dure 3 jours et les dérivés de l’artémisinine permettent de réduire la parasitémie d’au moins 90%. En partant de cette hypothèse, la molécule associée n’éliminera que 10% de la parasitémie ce qui permettra de réduire les cas de résistance. Ces combinaisons de molécules agissent différemment selon le stade et le site d’action.
Traitement du paludisme grave : L’antipaludique proposé pour ce type de paludisme est l’artésunate à 2,4 mg/kg de poids corporel administré par voie intraveineuse (IV) ou intramusculaire (IM). Si l’on n’a pas d’artésunate injectable, il peut être remplacé par l’artèméther à 3,2 mg/kg ou la quinine à 20 mg/kg (OMS, 2013).

Chimiorésistance

La chimiorésistance est un des obstacles majeurs qui entravent les programmes nationaux de lutte contre le paludisme depuis des décennies. L’organisation mondiale de la santé définit la chimiorésistance comme « l’aptitude d’une souche de parasite du paludisme à survivre ou à se reproduire malgré l’administration et l’absorption d’un médicament employé à des doses égales ou supérieures aux doses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites de tolérance du sujet ».
Mécanismes de la résistance : La résistance fait intervenir certains mécanismes comme l’altération d’enzymes qui sont des cibles d’antipaludiques et l’altération de l’accumulation de l’antipaludique dans le parasite résultant d’une diminution d’entrée ou d’une augmentation de sortie (efflux) de la molécule. Facteurs favorisant la résistance : Il existe beaucoup de facteurs qui favorisent la résistance et parmi eux avons : la pression médicamenteuse, le niveau de transmission, le non-respect des doses préinscrites, la diminution d’immunité de l’hôte et la variation antigénique du parasite. Méthodes de surveillance de la chimiorésistance : Pour pouvoir surveiller la résistance de ces parasites aux molécules d’antipaludiques trois approches sont utilisées : les tests in vivo, les tests ex vivo et les tests moléculaires.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I: GENERALITES SUR LE PALUDISME
I.1. Epidémiologie
I.1.1. Définition
I.1.2. Agents pathogènes
I.1.2.1. Classification
I.1.2.2. Morphologie
I.1.2.3. Cycle de développement
I.1.2.3.1. Le cycle chez l’Homme : la phase asexuée
I.1.2.3.2. Le cycle chez l’Anophèle : la phase sexuée
I.1.3. Vecteurs et transmission du paludisme
I.2. Clinique du paludisme
I.3. Diagnostic
I.3.1. Les méthodes de diagnostic directes
I.3.1.1. La Goutte Epaisse (GE) et le Frottis Mince (FM)
I.3.1.2. Tests de diagnostic rapide (TDR)
I.3.1.3. Quantitative Buffy Coat (QBC)
I.3.1.4. Méthodes moléculaires : PCR et Illumigen Malaria LAMP
I.3.2. Les méthodes de diagnostic indirectes : tests sérologiques
I.4. Méthodes de lutte contre le paludisme
I.4.1. Prophylaxie
I.4.1.1. Lutte antivectorielle
I.4.1.2. Chimioprévention
I.4.2. Traitement
I.4.2.1. Classification des antipaludiques
I.4.2.1.1. Les schizonticides
I.4.2.1.2. Les gamétocytocides
I.4.2.1.3. Les antibiotiques
I.4.2.2. Traitement du paludisme simple
I.4.2.3. Traitement du paludisme grave
I.5. Chimiorésistance
I.5.1. Définition
I.5.2. Mécanismes de la résistance
I.5.3. Facteurs favorisant la résistance
I.5.4. Méthodes de surveillance de la chimiorésistance
I.5.4.1. Tests in vivo
I.5.4.2. Tests in vitro
I.5.4.3. Tests moléculaires
CHAPITRE II: MATERIEL ET METHODES
II.1. Site d’étude
II.1.1. La région de Thiès
II.1.2. Section de lutte antiparasitaire (SLAP)
II.1.3. Population d’étude
II.1.3.1. Critères d’inclusion
II.1.3.2. Critères de non inclusion
II.2. Matériel et méthodes
II.2.1. Matériel
II.2.2. Méthodes
II.2.2.1. Prélèvement et acheminement
II.2.2.2 . DAPI test
II.2.2.2.1. Préparation des solutions et des plaques
II.2.2.2.2. Culture parasitaire
II.2.2.2.3. Mesure par fluorimétrie
II.2.2.2.4. Analyses statistiques
CHAPITRE III: RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. Résultats
III.1.1. Résultats cliniques et parasitologiques
III.1.2. Réponses ex vivo des isolats aux différents antipaludiques
III.1.3. Distribution des CI50 des molécules d’antipaludique étudiées
III.2. Discussion
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES