Cardiopathie sénescente

Cardiopathie liée au syndrome métabolique

Des rats Zucker obèses par mutation sur le gène de la leptine et des rats Zucker obèses et diabétiques sont utilisés comme modèle de cardiopathie de l’obèse associée ou non au diabète (Charles River, L’Arbresle, France).101, 104

Cardiopathie diabétique

Des rats Wistar mâles de 6 semaines (Janvier) sont répartis selon deux groupes: rats adultes sains et rats adultes rendus diabétiques. Le diabète est induit dans le groupe concerné par une injection intraveineuse unique de streptozotocine (65mg.kg-1 de poids corporel, Sigma-Aldrich, L’Isle d’Abeau Chesnes, France).2 Les animaux sont étudiés 6 semaines plus tard. Au moment de l’euthanasie, un prélèvement sanguin est pratiqué pour déterminer la glycémie et la réserve alcaline de chaque rat.

Traitement par atorvastatine

Des rats Wistar sains ou diabétiques (6 semaines après l’injection de streptozotocine) sont gavés quotidiennement avec 80mg.kg-1 d’atorvastatine pendant 15 jours consécutifs avant étude de la contractilité.

Effets inotrope et lusitrope de la stimulation β-adrénergique in vivo

Echocardiographie

Sous anesthésie générale par isoflurane (1 à 2%), les échocardiographies sont réalisées à l’aide d’un appareil Vivid 7 (General Electric, Aulnay-sous-Bois, France) équipé d’une sonde linéaire de 8-14 MHz. La fraction d’éjection du ventricule gauche (FEVG) et la fraction de raccourcissement du ventricule gauche (FRVG) sont mesurées sur une coupe para-sternale grand axe.2, 3 Les paramètres diastoliques du ventricule gauche sont obtenus à partir du Doppler pulsé du flux mitral : pics de vélocité de l’onde protodiastolique mitrale E et de l’onde télédiastolique mitrale A, temps de décélération de l’onde E et temps de relaxation isovolumétrique.2, 3 Le pic de vélocité de l’onde protodiastolique Ea par Doppler pulsé tissulaire (DTi) est enregistré à l’anneau mitral en fenêtre apicale 4 cavités. Le rapport E/A, reflet de la fonction diastolique du ventricule gauche et le rapport E/Ea, reflet des pressions de remplissage du VG sont calculés.2, 3 Les différents paramètres sont enregistrés après stabilisation en condition basale, puis après une injection intraveineuse de MK571 (30 mg.kg-1, Enzo Life Sciences)108 ou du même volume de NaCl 0.9% et enfin sous stimulation β-adrénergique par isoprotérénol (5 ou 10γg.kg.-1.min.-1 en intraveineux continu).

Mesure invasive de la pression artérielle

In vivo, les rats sont anesthésiés par pentobarbital (65 mg.kg-1 intrapéritonéal) pour enregistrer la pression artérielle. La carotide interne gauche des animaux est canulée avec un cathéter de polyéthylène connecté à un transducteur de pression (Gould Electronic, Cleveland, OH, USA). Après stabilisation, la pression artérielle et sa dérivée première en fonction du temps sont enregistrées. A partir de ces tracés on détermine la pression artérielle systolique et diastolique (respectivement PAS et PAD), la fréquence cardiaque et la vitesse maximale de croissance systolique de la pression artérielle (+dP/dt). Les différents paramètres sont enregistrés après stabilisation, en condition basale, puis après une injection intraveineuse de MK571 (30 mg.kg-1, Enzo Life Sciences)108 ou du même volume de NaCl 0.9% et enfin sous stimulation β-adrénergique par isoprotérénol (10γg.kg.-1.min-1 en intraveineux continu).

Effets inotrope et lusitrope de la stimulation β-adrénergique ex vivo

Sous anesthésie générale par pentobarbital (30mg.kg-1), le thorax des animaux est ouvert et le cœur rapidement prélevé. Les muscles papillaires sont soigneusement disséqués et suspendus dans une solution tampon bicarbonatée de Krebs-Henseleit, thermostatée et oxygénée, à une fréquence de stimulation de 12Hz, selon la technique précédemment décrite.2 Les muscles sont soumis des concentrations croissantes d’isoprotérénol en doses cumulatives de 10-8 à 10-4 M, un agoniste spécifique des récepteurs β-adrénergiques et en présence de phentolamine (10-6 M) pour bloquer la signalisation des récepteurs α-adrénergiques. L’effet inotrope positif a été évalué en mesurant la vitesse maximale de raccourcissement sans précharge en isotonie et la force active maximale en isométrie. L’effet lusitrope a été évalué en mesurant le rapport R1 entre les vitesses maximales de contraction et de relaxation en isotonie avec précharge et le rapport R2 entre les forces maximales de contraction et de relaxation en isométrie. Les courbes concentrations-effets ont été analysées en calculant l’effet maximum (Effmax) et la concentration produisant 50% de l’effet maximum (EC50).
La stimulation directe de l’adénylate cyclase par la forskoline ou l’administration d’un analogue de l’AMPc

Effets inotrope et lusitrope de la stimulation β-adrénergique in vitro

Isolement des cardiomyocytes

Sous anesthésie générale par pentobarbital, le cœur des rats est rapidement prélevé par sternotomie et connecté par l’aorte ascendante à un dispositif de Langendorf.109Par la canule aortique le cœur est d’abord perfusé avec un tampon Stock sans calcium (NaCl 117mM, KCl 5,7mM, KH2PO4 1,5mM, NaHCO3 4,4mM, MgCl2 1,7mM, Glucose 11,7mM, Créatine 10mM, HEPES 21mM, Taurine 20mM, Sigma Aldrich) ajusté à pH 7,1 à 25°C, bullé à l’oxygène pur et réchauffé à 36,5°C. Une solution oxygénée de collagénase A (0.204 U/mg) (Roche Diagnostics, Meylan, France) est ensuite perfusée.41, 110 Après digestion enzymatique, l’exérèse des oreillettes et une dissection mécanique complémentaire douce est pratiquée suivie d’une filtration. Les cardiomyocytes en suspension sont lavés et resuspendus dans le tampon Stock. Le calcium est ajouté progressivement. Les cellules sont analysées dans les six heures qui suivent l’isolement.

Etude Ionoptix® des cardiomyocytes

Les cardiomyocytes sont incubés avec du Fura2-AM (10-6M, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) pendant 20 minutes à température ambiante puis lavés et resuspendus dans un tampon Stock avec 0.5mM de calcium. La contractilité et la transitoire calcique des cardiomyocytes sont enregistrées sur une plateforme Ionoptix® (Ionoptix Corporation, Milton, MA, USA).111 Seuls les cellules rectangulaires à bords droits et sans bulles ni contraction spontanée sont étudiées. Les cardiomyocytes sont stimulés électriquement à 1 Hz et 8 Volts dans un bain à 25°C (Figure 17).
La longueur des sarcomères est déterminée par un microscope Olympus IX71à objectif inversé et une caméra. Les propriétés contractiles des cardiomyocytes sont analysées avec le logiciel IonWizard® software (Ionoptix®) par l’amplitude maximale de raccourcissement (PR), le délai entre le début et le pic du raccourcissement (TPR) et la vitesse maximale de raccourcissement (-dL/dt) pour la phase de contraction et le temps pour 90% de relaxation (TR90) et la vitesse maximale de relaxation (+dL/dt) pour la phase de relaxation.
Figure 17 : Plateforme d’analyse Ionoptix (A) et exemple de tracés de raccourcissement des sarcomères (B) et de transitoire calcique (C) obtenus simultanément sur des cardiomyocytes isolés. Images de collection personnelle obtenues sur des rats Wistar mâles de 12 semaines.
Les cardiomyocytes sont exposés en alternance à une lumière de 340 et 380nm provenant d’une source au xénon avec un système Hyperswitch Fluorescence System Interface®. La longueur d’onde de la lumière émise par l’exposition de la sonde Fura2 dépend de la concentration en calcium. L’intensité de fluorescence (FFI) émise aux deux expositions lumineuses est exprimée en ratio 340/380 qui est corrélé à la concentration intracellulaire en calcium.111 Les variations du calcium intracellulaire lors du cycle contraction-relaxation sont appelés transitoire calcique et décrites par ΔFFI, l’amplitude du pic de la transitoire calcique et après chaque stimulation électrique et la constante de décroissance (tau).
L’inhibition de MRP4 a été réalisée par un prétraitement de la moitié des cellules par MK571 (10-7M). La contraction et la fluorescence des cardiomyocytes ont été enregistrées après stabilisation en conditions basales et après ajout d’isoprotérénol (10-6M).