Caractérisation des STEC et des phages Stx

Détermination des sous-types du gène stx et des sites d’insertion des phages Stx 

L’étude des sous-types du gène stx a montré que les 74 souches étudiées possèdent essentiellement les sous-types stx1a (n = 56) et stx2a (n = 20). Un autre sous-type, stx2d, a été retrouvé dans une seule souche d’origine humaine. De plus, trois souches possèdent simultanément les deux sous-types (stx1a et stx2a) tandis que cinq souches possèdent deux copies du même sous-type. Lorsque l’on prend en compte l’origine des souches, on constate que la majorité des souches laitières (88,2%) et la totalité des souches bovines possèdent le sous-type stx1a tandis que les souches humaines possèdent en proportion équivalente les deux sous-types (stx1a et stx2a). L’étude des sites d’insertion des phages Stx a permis de mettre en évidence l’existence de quatre sites d’insertion préférentiellement occupés par les phages Stx dans les STEC O26:H11. Il s’agit des sites wrbA (37 souches), yehV (28 souches), et dans une moindre mesure, des sites yecE et sbcB. Aucun phage Stx n’a été détecté dans les cinq autres sites d’insertion étudiés (Z2577, prfC, argW, ssrA et la région intergénique torS-torT). De plus, pour les souches possédant deux phages Stx, des méthodes de PCR « long-template », visant à amplifier de long fragments d’ADN (>15kb), ont été développées pour déterminer le site d’insertion de chacun des phages. Ainsi, pour la souche 09QMA277.2, le phage Stx1a est intégré dans le site yehV et le phage Stx2a est intégré dans wrbA. Les souches 3073/00 et 3901/97 ont leur phage Stx2a localisé dans yecE et leur phage Stx1a intégré respectivement dans yehV et wrbA. Une analyse des combinaisons formées d’un sous-type du gène stx et d’un site d’insertion chromosomique du phage Stx en fonction de l’origine des souches a été effectuée. On a constaté que les souches d’origines laitière et bovine ont leurs phages Stx intégrés essentiellement dans wrbA et yehV, tandis que les souches humaines ont leurs phages Stx intégrés dans wrbA et yehV mais aussi dans le site yecE. En effet, yecE sert de site d’insertion dans 28% des souches humaines. Il est important de noter que toutes les souches humaines possédant un phage Stx2a intégré dans wrbA et yecE ont été à l’origine de SHU, indiquant une Etude expérimentale – Chapitre 1 83 forte virulence de ces souches. En revanche, ces profils sont absents (ou rarement retrouvés) dans les souches d’origines laitière et bovine. Pour finir, l’état des sites d’insertion a aussi été investigué dans 29 souches stxnégatives, pour vérifier l’absence de phages Stx ou bien seulement une délétion du gène stx qui se serait produite au cours du temps. Les résultats ont montré que les sites d’insertion sont intacts pour 25 des 29 souches stx-négatives, indiquant bien l’absence de phage Stx dans la majorité d’entre elles. Pour les quatre souches restantes, deux observations ont été faites. La première observation concerne les souches 5021/97 et 5080/97 pour lesquelles les sites yehV et yecE sont occupés par un phage Stx mais dont le gène stx est a priori délété. L’observation suivante concerne les souches 07QMA144.1 et F61-523 pour lesquelles un autre élément génétique, différent du phage Stx, a été détecté dans les sites argW et Z2577 respectivement

Caractérisation phylogénétique des STEC O26:H11 

Une étude phylogénétique par typage MLST a été réalisée sur 14 souches STEC de la collection. Les données de la littérature ont permis de classer ces souches selon deux séquences types, ST21 et ST29. Les souches stx2a qui sont à l’origine de SHU se distribuent entre ST21 et ST29. L’association du gène stx2 à ST21 ou à ST29 a été démontrée comme un indicateur de SHU. En revanche, aucune combinaison d’un sous-type du gène stx et d’un site d’insertion donné du phage Stx n’a révélé de corrélation avec un ST particulier.

Stabilité des prophages Stx 

Pour explorer la relation entre les STEC O26:H11 et les souches stx-négatives, une étude de la stabilité des prophages Stx a été effectuée au sein des cultures pures de STEC. Les quantités de sites attB et attL, témoignant respectivement de l’absence et de la présence d’un phage ont été déterminées. On a pu constater, pour chaque culture pure, une amplification simultanée des sites attB et attL, témoignant de l’excision spontanée du prophage Stx au cours de la croissance cellulaire. Des calculs de ratio attB/attL ont été effectués au niveau des quatre sites d’insertion chromosomiques (wrbA, yehV, yecE et sbcB). Ces ratios ont montré que ce phénomène d’excision spontanée n’est pas dépendant des sites d’insertion des phages Stx.

Mise en évidence de la présence d’un phage EspK dans le site ssrA 

Ces travaux ont aussi permis de mettre en évidence la présence dans les STEC O26:H11 d’un phage différent des phages Stx dans un site nommé ssrA. En effet, lors de la détermination des sites d’insertion des phages Stx, on a constaté que le site ssrA était souvent occupé chez les STEC O26:H11. L’hypothèse de la présence d’un phage EspK, codant un effecteur de type III, et intégré dans le site ssrA, a donc été émise. Les résultats ont montré que le phage EspK intégré dans ssrA est présent dans la majorité des STEC O26:H11 (soit 87,8%). En revanche, ce phage n’est présent que dans seulement 17,2% des souches O26:H11 stx-négatives. 

Conclusion

 En conclusion, ces travaux ont permis de mettre en évidence une variabilité des profils génétiques entre les souches STEC O26:H11 d’origines différentes. Il a été observé une grande diversité des sous-types du gène stx et des sites d’insertion des phages Stx issus de STEC O26:H11, avec quelques différences observées entre les souches humaines et les souches provenant des aliments et des bovins. Ces différences confirment d’autres travaux portant sur l’existence de différents clones de STEC O26:H11 possédant des niveaux de pathogénicité variés