Biologie et pathologies du pancréas

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Adénocarcinome canalaire pancréatique

Epidémiologie et facteurs de risques

En 2013 en France, le cancer du pancréas a touché 6039 femmes et plus de 6300 hommes (augmentation de plus de 6% par rapport à 2008), et environ 338000 personnes dans le monde, particulièrement dans les pays industrialisés. Il est le 7ème cancer le plus fréquent chez la femme et le 8ème chez l’homme (Rapport technique de l’INCa, 2017). Son incidence est toujours croissante (Bouvier et al. 2017), contrairement à la plupart des cancers, et si les tendances des dernières années se poursuivent, plus de 14000 patients seront diagnostiqués en 2018. Du fait du pronostic dramatique de ce cancer, la mortalité est virtuellement très proche. En effet, la survie moyenne à 5 ans reste inférieure à 7%, et la plupart des patients 23 décèdent dans les 6 mois suivant le diagnostic. Cette mortalité élevée en fait le quatrième cancer le plus mortel en France. En l’absence d’avancée thérapeutique significative, il pourrait devenir le deuxième d’ici à 2030.
Le cancer du pancréas survient habituellement entre 60 et 80 ans (plus de 80% des cas), et reste rare avant 50 ans (10% des cas). Il est légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme (ratio 1,3 : 1). Il n’a pas de cause précise connue, mais de nombreux facteurs de risques ont été identifiés :
– le principal est le tabac, impliqué dans près d’un quart des cancers du pancréas, il multiplie par trois le risque de survenue ;
– l’alimentation joue un rôle qui est discuté : une alimentation riche en graisses et en protéines, ainsi qu’une consommation excessive d’alcool augmenterait modérément le risque, tandis qu’une consommation importante de fruits et de légumes aurait un léger effet préventif ;
– le diabète peut favoriser légèrement l’apparition d’un cancer, mais le risque de développer un cancer pour un patient diabétique est inférieur à 3% (contre environ 0,01% en moyenne) ;
– enfin, certaines maladies pancréatiques rares comme les pancréatites peuvent favoriser l’apparition du cancer. Les formes familiales génétiques sont rares et représentent moins de 10% des cancers du pancréas, mais la probabilité de développer un cancer dans ces familles est extrêmement augmentée (multipliée par 69).
Les signes d’appel sont souvent aspécifiques, comme la douleur dorsale, les troubles dyspeptiques et les troubles du transit, et ressemblent beaucoup à d’autres désordres digestifs (pancréatite, hépatite, hernie hiatale) ; d’autres sont plus révélateurs comme l’ictère et la pancréatite. Une poussée initiale de pancréatite aigüe est retrouvée dans 15% des cas. Les tableaux cliniques constitués associent à des degrés différents trois signes principaux : l’ictère, la douleur, l’altération de l’état général (amaigrissement surtout). L’ictère est le signe le plus évocateur et devient de plus en plus foncé, il résulte d’une compression par la tumeur du canal biliaire avec une rétention biliaire consécutive. La douleur est présente 9 fois sur 10 et constitue le premier symptôme chez plus de deux tiers des patients. Elle varie selon la situation de la tumeur avec une origine épigastrique ou dorsale, irradiant en ceinture ou vers l’épaule. Elle peut être d’intensité variable, et devient progressivement permanente et inexorable. L’altération de l’état général est quasi constante dans les tumeurs malignes. L’amaigrissement et l’asthénie sont précoces, mal expliqués et sans relation évidente avec le volume tumoral. Des troubles de la glycorégulation sont également fréquent, et une intolérance au glucose est présente chez près de 80% des malades.
Ce manque de symptôme spécifique entraîne un diagnostic très tardif. Les symptômes deviennent plus prononcés avec la progression de la maladie, et le diagnostic repose surtout sur l’association d’une altération de l’état général avec troubles digestifs et l’imagerie médicale (échographie, radiographie, IRM, échoendoscopie, …). A l’heure actuelle et même si de nombreuses recherches sont en cours, aucun marqueur tumoral ne permet un diagnostic précoce du cancer du pancréas ; certains sont utilisés dans la surveillance d’un cancer traité (l’antigène carcino-embryonnaire ACE et le CA 19-9 principalement). L’élévation de ces marqueurs, si elle ne permet pas le diagnostic, est souvent corrélée avec le volume tumoral et joue plutôt un rôle pronostic.
Dans 95 % des cas, la tumeur se développe aux dépens des cellules exocrines : on parle d’adénocarcinome du pancréas. Les autres tumeurs potentiellement malignes du pancréas sont les tumeurs neuroendocrines qui se développent au dépend des cellules des îlots de Langerhans. Elles sont beaucoup plus rares et leur prise en charge diffère totalement.

Biologie du PDAC

Sur 12000 nouveaux cas de cancer du pancréas diagnostiqués chaque année (InCA), plus de 11000 sont des adénocarcinomes (PDAC). Il représente plus de 90% des cancers de pancréas, et se caractérise par une destruction des cellules acineuses exocrines et l’apparition de cellules cancéreuses ayant un phénotype canalaire. Les cellules cancéreuses de PDAC présentent une ressemblance avec les cellules canalaires pancréatiques au niveau histologique, avec une forme cubique, l’expression d’antigène canalaire (Cytokératine-19 CK19), et la croissance dans des structures tubulaires, mais n’ont pas toutes des origines canalaires. L’agressivité de ce cancer s’explique en partie par sa forte propension à disséminer rapidement, associée à sa résistance aux traitements conventionnels et aux thérapies ciblées. Le PDAC touche souvent la tête du pancréas (70%), ainsi que le corps dans 15% des cas et la queue dans 10%. Une infiltration dans les tissus environnants est souvent retrouvée, notamment dans les vaisseaux lymphatiques, la rate, la cavité péritonéale, et avec l’apparition 25 rapide de métastases hépatiques et pulmonaires. Ce cancer se caractérise aussi par la présence d’un stroma dense et réactif, qui sera décrit dans la deuxième partie de ce travail. Le cancer se développe après trois principales lésions précurseurs, les PanINs, ou « Pancreatic intraepithelial neoplasia », les néoplasies mucineuses kystiques et les néoplasies mucineuses papillaires intracanalaires. La plus connue et la plus étudiée est la lésion PanIN, qui apparaît avec l’âge. Les PanINs sont des lésions intracanalaires non-invasives classées par sévérité croissante du niveau 1 au niveau 3. Les niveaux 1 et 2 correspondent à des lésions précancéreuses, et le niveau 3 à un carcinome in situ évoluant vers le PDAC (Figure 3). Les lésions PanIN1 et PanIN2 peuvent être retrouvées dans les pancréas non cancéreux de sujets âgés (retrouvées chez 30% des sujets âgées autopsiés) (Maitra et al. 2005 ; Hezel et al. 2006).
Le développement de ces lésions est associé à l’apparition d’altérations génétiques précoces et tardives (Moskaluk et al. 1997). L’activation de l’oncogène KRAS est un des évènements génétiques les plus précoces, qui induit la modification de nombreuses fonctions cellulaires comme la prolifération, la différenciation et la survie via l’activation de nombreuses voies de signalisation, comme la voie RAF-mitogen-activated-kinase (MAPK), la voie phosphoinositide-3-kinase (PI3K). Cette mutation est retrouvée dans environ 30% des néoplasies précoces du pancréas, et dans presque 100% des PDAC avancés.
La mutation du gène p16/INK4a est précoce, retrouvée dans 80% des PDAC, et empêche l’effet de blocage du cycle cellulaire par inhibition de CDK 4/6, ce qui conduit à une augmentation de la prolifération cellulaire. La mutation du gène suppresseur de tumeur p53 est un évènement génétique plus tardif, retrouvé dans plus de 50% des PDAC. Le gène p53 est le gène « gardien du génome » ; il permet, lorsqu’une mutation survient, de faciliter l’arrêt du cycle cellulaire et la réparation de l’ADN. Si la réparation est impossible, il permet l’apoptose et l’élimination des cellules mutées. La perte des fonctions de p53 entraîne l’accumulation de lésions génétiques, avec l’augmentation de la croissance et de la survie des cellules portant des aberrations chromosomiques pro-carcinogènes. Enfin, l’inactivation du gène Smad4/DPC4 est tardive, retrouvée dans 50% des PDAC, et conduit à la perte de fonction de ce facteur de transcription essentiel pour l’effet inhibiteur du TGFβ sur la prolifération des cellules cancéreuses.

Modèles expérimentaux d’étude du PDAC

Modèles cellulaires

La première lignée humaine de cancer du pancréas, la lignée CaPa a été isolée en 1963 par Dobrynin (Dobrynin, 1963). Depuis, de nombreuses autres ont été établies, décrites au niveau mutationnel et phénotypique, et une quinzaine d’entre elles sont classiquement utilisée en recherche préclinique (MiaPaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-1/2, notamment) (Deer et al. 2010). Ces lignées sont particulièrement utiles dans le développement de nouvelles thérapies, et sont le plus souvent la première étape dans le criblage pharmacologique des molécules isolées et produites chimiquement. Leurs principaux avantages sont le coût réduit des manipulations (en comparaison aux études sur l’animal), l’homogénéité des cellules, la rapidité et la facilité à les amplifier. Ce sont également de très bons outils pour des modifications génétiques (transfections, ARN interférents, gain ou perte d’expression d’un gène cible par exemple). L’étude des spectres d’expression génique dans différentes lignées issues de patients peut également être utile pour corréler des variations d’un gène donné à un bon ou mauvais pronostic, ou à des réponses à des traitements, et ainsi contribuer à la découverte de cibles en validant fonctionnellement des résultats obtenus sur tumeurs de patients (Collisson et al. 2011).
Cependant, et malgré leur utilité indiscutable, les lignées cellulaires isolées présentent aussi de nombreuses failles et défauts. Il est d’abord important de remarquer que la grande 27 majorité des recherches précliniques est réalisée sur une dizaine de lignée de PDAC différentes. Ces lignées ne représentent absolument pas toutes les différences observables dans les cancers du pancréas, qui se caractérisent par une importante hétérogénéité inter-patients (Cros et al. 2017). Le deuxième défaut majeur est lié à la culture cellulaire elle-même. Au sein d’une tumeur, les cellules sont polarisées et organisées en structure en trois dimensions, alors qu’elles poussent en couches uniques au laboratoire, sans organisation et sans différentiation fonctionnelle. De plus, et de manière particulièrement importante dans la cadre du PDAC, un biais des lignées cancéreuses est l’absence de microenvironnement. En effet, il est maintenant clairement admis que celui-ci n’est pas neutre au sein et de la tumeur, et qu’il joue au contraire un rôle majeur dans la capacité de prolifération, d’invasion, de chimiorésistance des cellules cancéreuses. Les travaux de Gadaleta et ses collaborateurs ont mis en évidence des différences de profils d’expression géniques entre des tissus provenant de patients, des tissus de xénogreffes et des lignées cellulaires, suggérant un rôle important du microenvironnement tumoral (Figure 4) (Gadaleta et al. 2011).
Enfin, il faut prendre en compte la probable sélection ou dérive génétique de clones sur les lignées isolées de tumeurs. Cette sélection peut se faire au cours de l’établissement de la lignée, avec une survie préférentielle de clones plus résistants ou plus prolifératifs, mais également au fur et à mesure des passages et du maintien de la lignée, avec l’apparition de nouvelles mutations qui ne reflètent pas celles présentes dans la tumeur primaire. Les traitements efficaces sur ces clones ne seront donc à priori pas efficaces sur l’ensemble des clones présents dans la tumeur, et encore moins sur les clones métastatiques. Même si les lignées constituent des modèles incontournables pour la recherche et le développement de cibles, d’autres modèles d’étude sont donc indispensables pour appréhender la complexité de la biologie du PDAC.

Greffes

Les greffes de cellules cancéreuses sont utilisées comme un équivalent in vivo des lignées cellulaires, pour confirmer les résultats obtenus in vitro. Elles consistent en l’injection de cellules en culture, ce qui permet d’obtenir rapidement des résultats sur l’animal et de produire des cohortes homogènes et importantes. L’injection qui peut être orthotopique, c’est-à-dire dans le tissu d’origine des cellules (dans le pancréas dans le cas du PDAC), ou ectopique (dans un tissu différent), classiquement en sous-cutané. L’avantage des greffes orthotopiques est qu’elles impliquent le recrutement d’un microenvironnement au niveau de l’organe d’origine, qui sera théoriquement plus proche du microenvironnement de la tumeur humaine que dans le cas d’une injection sous-cutanée, avec donc une meilleure cohérence par rapport aux résultats cliniques. Il faut aussi distinguer les xénogreffes, où le donneur est d’une espèce biologique différente du receveur, comme c’est le cas lors des injections de cellules cancéreuses humaines dans des modèles murins immunodéficients, et les allogreffes, injections de cellules isolées de tumeurs murines dans des souris. Lorsque les souris « donneuses » et « receveuses » sont d’un fond génétique identique, on parle de greffes yngéniques, qui peuvent être réalisées sur des souris immunocompétentes. La composante immunitaire du microenvironnement est alors présente et peut être étudiée, ce qui améliore aussi la pertinence biologique par rapport au cancer humain.
Malheureusement, les observations faites sur ces modèles sont assez peu prédictives des résultats sur l’humain, et on estime que seulement environ un tiers (37%) des résultats précliniques sont avérés ensuite en clinique (Hackam et Redelmeier 2006). Les réponses 29 thérapeutiques sont également assez variables entre les modèles de greffes et la clinique. Par exemple, l’équipe de Radinsky a montré en 2000 un effet drastique de l’association de la gembitabine et d’un anticorps bloquant le récepteur à l’EGF sur une lignée L3.6pl de PDAC, avec une réduction du volume tumoral et des métastases (Bruns et al. 2000). Dix ans plus tard, une étude de phase III comparant la gemcitabine seule ou en association avec le cetuximab, un anticorps anti-EGFR, échouait à montrer un bénéfice de l’accociation (Philip et al. 2010). Ces résultats peu prédictifs s’expliquent par différents facteurs, dont certains comparables aux défauts des lignées cellulaire. En effet, les lignées isolées et amplifiées ont favorisé certains clones tumoraux au détriment d’autres, et ont certainement acquis de nouvelles mutations : la tumeur formée à partir de ce clone sera donc fondamentalement différente d’une tumeur naturelle. Il faut ajouter que les tumeurs formées à partir d’une lignée prennent la forme de masses cellulaires homogènes, même si un microenvironnement est recruté, l’infiltration de la tumeur par celui-ci est limitée. Dans le cas du PDAC, ce phénomène est problématique quand on sait que les tumeurs sont composées en majorité de cellules du microenvironnement et de matrice acellulaire. Une alternative peut être d’injecter simultanément aux cellules cancéreuses des cellules du microenvironnement, comme des macrophages ou des fibroblastes, pour se rapprocher d’avantage des tumeurs humaines. Il y a enfin un certain nombre de paramètres inhérents à l’expérience qui peuvent considérablement influencer les résultats : par exemple le site d’injection, la vitesse de croissance tumorale, le volume tumoral au moment de l’initiation du traitement, ou encore la dose, la voie d’administration et la formulation de la molécule testée. D’autres modèles plus évolués et pertinents sont donc indispensables pour améliorer l’efficacité de la phase préclinique.

PDX

C’est pour combler une partie des failles des greffes de cellules que les xénogreffes dérivées de patients (PDX) ont été développées. Ces PDX consistent en l’implantation en orthotopique ou en ectopique de fragments de tumeurs provenant d’une résection tumorale ou de biopsies provenant d’écho-endoscopie. L’apport majeur de ces greffes est que les cellules transplantées maintiennent les caractéristiques histologiques et génétiques de la tumeur d’origine, et restent stables au cours des passages d’une souris à l’autre (Jung et al. 2016). Un autre avantage est que les fragments contiennent toujours le microenvironnement de la tumeur humaine. Au fur et à mesure des passages, le stroma humain ne se maintient pas et est remplacé par le stroma murin, qui va contribuer à la prise tumorale (Delitto et al. 2015). Les PDX sont également des relativement bons reflets des tumeurs initiales, notamment au niveau de la réponse aux thérapies puisque une étude a montré que les sensibilités des tissus dérivés de PDX à la gemcitabine à l’irinotecan était cohérentes par rapport aux réponses cliniques des patients desquels dérivaient les PDX (Roife et al. 2016).
Ces propriétés (maintien des caractéristiques histologiques, génétiques, réponse aux traitements) font des PDX de bons candidats pour les tests de molécules, la recherche de biomarqueurs, mais aussi pour le développement de traitements personnalisés. Dans une étude de 2015, Gao et ses collaborateurs ont utilisé environ 1000 PDX de six types de cancers solides, dont des PDAC, pour tester 62 traitements différents. Ils montrent une reproductibilité et une cohérence avec les résultats cliniques en identifiant des associations entre des génotypes particuliers et des réponses thérapeutiques (Figure 5) (Gao et al. 2015).
Une stratégie de médecine personnalisée utilisant les PDX est détaillée dans la figure 6 : en parallèle de la constitution de cohortes de PDX, l’analyse génétique des échantillons provenant directement du patient permet d’identifier des stratégies thérapeutiques. Les molécules sont ensuite testées sur la colonie de PDX afin de mettre en évidence le traitement le plus efficace. Malheureusement, il y a également plusieurs inconvénients majeurs avec les PDX, particulièrement dans le cas du PDAC. D’abord, les transplantations ne réussissent pas toujours, et il est nécessaire de parvenir à un taux de succès d’au moins 60%, pour la médecine personnalisée, mais aussi pour que les collections de PDX soient représentatives de l’hétérogénéité inter-patient car il a été montré que les tumeurs plus agressives étaient plus facilement transplantables (Hidalgo et al. 2014). Un autre facteur problématique est le taux de résection des tumeurs pancréatiques autour de 15%, ce qui implique que l’utilisation de PDX pour la mise au point de traitements personnalisés ne bénéficiera qu’à une faible proportion de patients. Il faudrait améliorer les techniques de transplantation pour permettre de générer les PDX à partir de petites quantités de tissu tumoral, par exemple avec des prélèvements d’endoscopie, ce qu’a réussi à réaliser l’équipe de Iovanna avec un taux de réussite toutefois moindre qu’avec les pièces d’exérèse chirurgicale (Nicolle et al. 2017). Il faut également prendre en compte le fait que la création de PDX, au-delà du coût important, peut prendre plus de 6 mois. Cette durée est simplement trop longue dans le cas du PDAC, quand on sait que la médiane de survie après le diagnostic est autour de 6 mois.

Table des matières

INTRODUCTION
I) Biologie et pathologies du pancréas
1) Anatomie et physiologie du pancréas
a) Anatomie
b) Physiologie
2) Adénocarcinome canalaire pancréatique
a) Epidémiologie et facteurs de risques
b) Biologie du PDAC
c) Modèles expérimentaux d’étude du PDAC
II) Microenvironnement du PDAC
1) Généralités
2) CAFs
a) Origines
b) Rôle dans la progression tumorale et la résistance aux traitements
c) Rôle immunomodulateur
d) Rôle ambigu et hétérogénéité des CAFs
3) Matrice extracellulaire
a) Collagènes
b) Glycosaminoglycanes et protéoglycanes
c) Glycoprotéines
d) Protéases
e) Rigidité et propriétés mécaniques de la matrice
4) Immunité
a) Populations anti-tumorales
b) Macrophages associés aux tumeurs
c) Neutrophiles associés aux tumeurs
d) Cellules myéloïdes suppressives MDSC
e) Lymphocytes T régulateurs
III) Biologie de la métastase
1) Processus métastatique
a) Invasion locale
b) Intravasation
c) Survie dans la circulation sanguine
d) Arrêt à distance et extravasation
e) Micrométastase
f) Colonisation
2) Bases moléculaires de la métastase
a) RAS/RAF/MEK/ERK
b) PI3K/Akt/mTOR
c) HGF/c-MET
d) Wnt/B-Caténine
e) JAK/STAT
3) Rôle pro-métastatique du microenvironnement tumoral
a) Interactions sur le site primaire
b) Microenvironnement au site métastatique
4) Métastases et PDAC
a) Altérations génétiques
b) Sous-types tumoraux
c) Dérégulations de miARNs
d) Cellules souches cancéreuses
e) Exosomes
IV) Stratégies thérapeutiques innovantes dans le PDAC
1) Thérapies actuelles
a) Tumeurs résécables d’emblée
b) Tumeurs localement avancée
c) Formes métastatiques
2) Diagnostic précoce
a) Généralités
b) Signature génétique et épigénétique
c) ARN non codants
d) Biopsies liquides
3) Thérapies ciblées
a) Ciblage moléculaire
b) Ciblage de la matrice
c) Immunothérapie
4) Ciblage des CAFs
a) Reprogrammer les CAFs
b) Somatostatine et Analogues de Somatostatine
RESULTATS EXPERIMENTAUX
I) Potentiel anti-métastatique du SOM230 : ciblage pharmacologique indirect des fibroblastes associés au cancer
II) Le ciblage pharmacologique du dialogue entre CAFs et macrophages M2 empêche le développement de métastases dans le PDAC
III) DISCUSSION GENERALE & PERSPECTIVES
Modèles de PDAC
Implications des CAFs, des macrophages et de leurs sécrétions dans le développement de métastases
Effets du SOM230 sur d’autres types cellulaires
Conclusion générale
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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