Bases mécanistiques des effets d’un insecticide sur la fonction thyroîdienne chez le rat

Bases mécanistiques des effets d’un insecticide
sur la fonction thyroîdienne chez le rat

Perturbation des enzymes responsables de la métabolisation des hormones thyroïdiennes

Le foie joue un rôle prépondérant dans le métabolisme des hormones thyroïdiennes. C’est en effet, un site majeur de sécrétion et de dégradation des protéines de transport citées plus haut mais également de conversion, de dégradation et d’excrétion des hormones thyroïdiennes (Klachko and Johnson, 1983; Kelly, 2000, figure 7).

Les désiodases

La désiodation est une voie majeure de métabolisation des hormones thyroïdiennes chez l’Homme avec jusqu’à 85% de la T4 et environ 50% de la T3 et de la rT3 métabolisées par cette voie (Curran and DeGroot, 1991). Trois désiodases ont été identifiées (D1, D2 et D3). Ce sont des sélénoenzymes membranaires ou du réticulum endoplasmique de 29 à 31.5 kDa (Beckett and Arthur, 2005; Bianco and Kim, 2006) qui catalysent la suppression d’un iode de la position 5 ou 5′ des iodothyronines (figure 6). Figure 6: Sites de suppression potentielle d’un iode par les désiodases. La désiodase D1 peut catalyser une suppression d’iode sur l’anneau interne ou sur l’anneau externe des iodothyronines, elle est donc responsable de la formation de l’hormone thyroïdienne 3,3′,5-T3 (forme active) à partir de la « pro-hormone » 3,3′,5,5′-T4 (désiodation sur l’anneau externe), de 3,3′,5′-rT3 inactive à partir de 3,3′,5,5′-T4 (désiodation sur l’anneau interne) et de 3,3′-T2 inactive à partir de 3,3′,5-T3 (désiodation sur l’anneau interne) ou de 3,3′,5′-rT3 (désiodation sur l’anneau externe). Elle catalyse également la désiodation de la T3 sulfoconjuguée. La désiodase D2 ne catalyse qu’une suppression d’iode sur l’anneau externe des iodothyronines et est responsable de la formation de 3,3′,5-T3 à partir de 3,3′,5,5′-T4 et de 3,3′-T2 à partir de 3,3′,5′-rT3. La désiodase D3 ne catalyse qu’une suppression d’iode sur l’anneau interne et est responsable de la formation de 3,3′,5-rT3 à partir de 3,3′,5,5′-T4 et de 3,3′-T2 à partir de 3,3′,5-T3. Ces trois désiodases diffèrent par leur spécificité de substrat et leur distribution tissulaire (tableau 8), mais également suivant l’âge, l’espèce, le régime alimentaire, et le statut hormonal (Bianco and Kim, 2006). D1 D2 D3 Poids moléculaire 29 kDa 30.5 kDa 31.5 kDa Substrats rT3, T3S, T4, T3 T4, rT3 T3, T4 Km apparent (M) 10-7 – 10-6 10-9 10-9 Temps de demi-vie Quelques heures Environ 20 minutes Quelques heures Localisation cellulaire Membrane plasmique Réticulum endoplasmique Membrane plasmique Distribution tissulaire Foie, reins, thyroïde, hypophyse SNC, hypophyse, tissu adipeux brun, placenta, thyroïde, cœur, moelle épinière Placenta, SNC, peau, foie du fœtus Tableau 8: Propriétés biochimiques et distribution tissulaire des désiodases chez l’Homme. rT3: reverse-triiodothyronine, T3: triiodothyronine; T4: thyroxine, T3S: T3 sulfoconjuguée, SNC: système nerveux central. D’après Beckett and Arthur, 2005; Bianco and Kim, 2006.

Les enzymes de conjugaison

La conjugaison des hormones thyroïdiennes est effectuée par des UGT (UDPglucuronosyltransférases) microsomales et des SULT (sulfotransférases) cytosoliques. Elle a pour but d’augmenter la solubilité dans l’eau des hormones thyroïdiennes et ainsi de faciliter leur excrétion rénale et biliaire (Watkins and Klaassen, 1983; Gamage et al., 2006). La glucuronoconjugaison a majoritairement lieu dans le foie. C’est une voie importante de métabolisation de la T4 chez le rat alors que la capacité de glucuronoconjugaison du foie humain est controversé. Chez le rat, environ 25% d’une dose de T4 administrée par voie orale est excrétée en 24h via la bile dont 50% sous forme glucuronoconjuguée (Curran and DeGroot, 1991). La glucuronoconjugaison de la T3 est moins importante que la glucuronidation de la T4 chez le rat et serait quasi inexistante chez l’Homme (Wu et al., 2005). Des métabolites de la T4 ou de la T3 comme l’acide tetraiodothyroacétique (Tetrac), l’acide triiodothyroacétique (Triac), la rT3 ou la T2 peuvent également être glucuronoconjugués. Aucune désiodation des molécules conjuguées n’est décrite (Curran and DeGroot, 1991). Chez l’Homme, quatre familles d’UGT ont été identifiées: UGT1, UGT2, UGT3 et UGT8. Elles sont localisées majoritairement dans le foie mais on en trouve également dans l’intestin, les reins, le cerveau, le pancréas, le placenta ou l’épithélium nasal. Seules les familles UGT1 et UGT2 utilisent de l’acide uridine 5′-diphosphoglucuronique (UDPGA) comme cofacteur pour glucuronoconjuguer leurs substrats (Jancova et al., 2010). Ce sont ces deux familles d’UGT qui sont responsables de la glucuronidation des hormones thyroïdiennes, les UGT1 qui conjuguent préférentiellement la bilirubine et les phénols étant plus spécifiques de la T4 et de la rT3 et les UGT2 qui conjuguent préférentiellement l’androstérone étant plus spécifiques de la T3 (Visser et al., 1993a). Il existe des différences interspécifiques en ce qui concerne les isoformes qui conjuguent préférentiellement les hormones thyroïdiennes. La T4 et la rT3 sont par exemple considérées comme étant majoritairement conjuguées par les isoformes UGT1A1 et UGT1A6 chez le rat et par les isoformes UGT1A1 et UGT1A9 chez l’Homme (Emi et al., 2007). La sulfoconjugaison a également majoritairement lieu dans le foie. A l’inverse de la glucuronoconjugaison, il y a une relation étroite entre la sulfoconjugaison et la désiodation. En effet, les désiodases peuvent métaboliser les produits sulfoconjugués et sembleraient même avoir une plus grande affinité pour les produits sulfoconjugués que pour les hormones thyroïdiennes natives. Le taux de désiodation sur l’anneau interne de la T3S serait par exemple 30 fois plus élevé que celui de la T3. Enfin, les sulfotransférases catalysent préférentiellement la conjugaison de la 3,3′-T2 formée par désiodation et celle de la 3′-T1 (monoiodothyronine) plutôt que celle de la T3 ou encore de la T4 et de la rT3 majoritairement glucuronoconjuguées (Curran and DeGroot, 1991). Chez l’Homme et chez le rat, trois familles de SULT ont été identifiées: SULT1, SULT2 et SULT3/4 (Wu et al., 2005; Gamage et al., 2006). Une quatrième famille a également été décrite chez l’Homme: la SULT6. Ce sont les SULT1 spécifiques des phénols et les SULT2 spécifiques des hydroxystéroïdes qui conjuguent les hormones thyroïdiennes (Wu et al., 2005). Chez l’Homme, les isoformes des SULT1 sont exprimées dans le foie, le cerveau, les seins, l’intestin, le jéjunum, les poumons, les surrénales, l’endomètre, le placenta, les reins et les plaquettes sanguines. La SULT2A1 est exprimée dans le foie, les surrénales du fœtus et de l’adulte, le duodénum et les isoformes des SULT2B dans la prostate, le placenta, les surrénales, les ovaires, les poumons, les reins et le colon. La SULT4A1 a seulement été identifiée dans le cerveau et la SULT6B1 dans les testicules et les reins. Le PAPS (3′-phosphoadénosine 5′-phosphosulfate), synthétisé dans tous les tissus chez les mammifères, est le donneur universel du groupement sulfate pour toutes les réactions de sulfoconjugaison quelle que soit l’isoforme des SULT impliquée (Jancova et al., 2010). Il existe des différences interspécifiques et entre sexes en ce qui concerne les isoformes qui conjuguent les hormones thyroïdiennes. L’isoforme SULT1C1 joue par exemple un rôle important dans la sulfoconjugaison des hormones thyroïdiennes chez le rat mâle alors que P ce sera plutôt l’isoforme SULT1B1 chez le rat femelle ou l’isoforme SULT1A1 chez l’Homme (Visser et al., 1998).

Clivage de la liaison éther L

Le clivage de la liaison éther de la T4 ou de la T3 consiste en la rupture du noyau thyronine au niveau de sa liaison éther afin de libérer une diiodotyrosine à partir de l’anneau interne et une quinone après désiodation de l’anneau externe (Oziol et al., 2001; Wu et al., 2005). Cette réaction serait catalysée par une peroxydase, probablement en présence d’H2O2 (Burger et al., 1983; Kubota et al., 1985). Chez l’Homme sain, le clivage de la liaison éther serait une voie métabolique des hormones thyroïdiennes de faible importance, la proportion de DIT rejoignant le plasma provenant plutôt de la thyroïde et de l’hydrolyse de la thyroglobuline. Le clivage de la liaison éther pourrait être plus important chez le rat, ou chez l’Homme dans certaines conditions pathologiques associées à une leucocytose élevée (Schoenmakers, 1994). Enfin, la présence d’une source extrathyroïdienne de monoiodotyrosine provenant de la désiodation de la diiodotyrosine à été suggérée chez l’Homme (Tan et al., 1990).

Table des matières

INTRODUCTION
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A. LES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS
1. DEFINITION
2. INTERET DE L’ETUDE DES PERTURBATEURS THYROÏDIENS
B. PERTURBATEURS THYROÏDIENS ET SYNTHESE DES HORMONES THYROÏDIENNES
1. PERTURBATION DE LA PRODUCTION DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. La production des hormones thyroïdiennes
b. Inhibition de la captation de l’iode
c. Inhibition de la thyroperoxydase
2. PERTURBATION DU RETROCONTROLE NEGATIF
a. Une régulation hypothalamo-hypophysaire
b. Inhibition de la libération des hormones thyroïdiennes
C. PERTURBATEURS THYROÏDIENS ET TRANSPORT DES HORMONES THYROÏDIENNES
1. PERTURBATION DU TRANSPORT PLASMATIQUE DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. La Thyroxine-Binding Globulin
b. La Transthyrétine
c. L’albumine
d. Différences interspécifiques
e. Liaison compétitive avec les protéines de transport plasmatiques
2. PERTURBATION DU TRANSPORT CELLULAIRE DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. Les Organic Anion-Transporting Polypeptides
b. Les Multidrug Resistance-Associated Protein
c. Les Monocarboxylate Transporters
d. Les L-type Amino acid Transporters
e. Le Na+
/Taurocholate Cotransporting Polypeptide
f. Modulation du transport membranaire
D. PERTURBATEURS THYROÏDIENS ET METABOLISME DES HORMONES THYROÏDIENNES
1. PERTURBATION DES ENZYMES RESPONSABLES DE LA METABOLISATION DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. Les désiodases
b. Les enzymes de conjugaison
c. Clivage de la liaison éther
d. Désamination et décarboxylation
e. Bilan des voies de métabolisation des hormones thyroïdiennes
f. Modulation de la métabolisation des hormones thyroïdiennes
2. UNE REGULATION DU METABOLISME VIA DES RECEPTEURS NUCLEAIRES XENOSENSEURS
a. Structure et fonctionnement des récepteurs nucléaires
b. Récepteurs nucléaires xénosenseurs et métabolisme des hormones thyroïdiennes
E. PERTURBATEURS THYROÏDIENS ET ACTION DES HORMONES THYROÏDIENNES
1. PERTURBATION DES RECEPTEURS NUCLEAIRES DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. Les récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes
b. Corépresseurs et coactivateurs
c. Modulation de l’activité des récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes par des contaminants
2. LE CAS PARTICULIER DES RECEPTEURS MITOCHONDRIAUX
F. LE CAS DE L’INSECTICIDE AGROVETERINAIRE FIPRONIL
1. HISTORIQUE ET LEGISLATION
2. MODE D’ACTION
3. METABOLISME
4. LES DONNEES DES EVALUATIONS TOXICOLOGIQUES REGLEMENTAIRES
a. Toxicité aiguë
b. Effet perturbateur thyroïdien du fipronil et différences interspécifiques
c. Un effet perturbateur thyroïdien du fipronil qui peut être lié à la métabolisation du fipronil en fipronil sulfone
G. OBJECTIFS ET PROJET DE THESE
ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE 1: MODELES D’ETUDE ET METHODES D’ANALYSE GENERAUX
A. TRAITEMENT AU FIPRONIL ET AU FIPRONIL SULFONE
1. FIPRONIL
2. FIPRONIL SULFONE
3. PIPERONYL BUTOXIDE
4. PREPARATION DES SOLUTIONS DE TRAITEMENT
5. MODALITES D’ADMINISTRATION DES TRAITEMENTS
B. MODELES ANIMAUX
1. ORIGINE ET HEBERGEMENT DES ANIMAUX
2. MODELE DE RAT PSEUDO-EUTHYROÏDIEN
3. PRELEVEMENTS SANGUINS SERIES
4. PRELEVEMENTS TERMINAUX
C. MODELES CELLULAIRES
1. ORIGINE ET OBTENTION DES HEPATOCYTES
2. REACTIFS
3. MODALITES DE MISE EN CULTURE DES HEPATOCYTES
D. METHODES D’ANALYSE
1. DOSAGE DU FIPRONIL ET DU FIPRONIL SULFONE
a. HPLC/MS/MS
b. HPLC/UV/MS
c. UPLC/MS/MS
2. DOSAGE DES HORMONES THYROÏDIENNES
a. T4, T3 et TSH par dosage radioimmunologique
b. Métabolites des hormones thyroïdiennes et C6-LT4 par UPLC/MS/MS
3. DETERMINATION DES EXPRESSIONS DES ARNM PAR RT-QPCR
a. Toxicologie comparative du fipronil et du fipronil sulfone in vivo
b. Mécanismes moléculaires de la perturbation thyroïdienne engendrée par un traitement au fipronil
4. ANALYSES PHARMACOCINETIQUES
a. Thyroxine et antipyrine in vivo
b. Thyroxine in vitro
5. ANALYSES STATISTIQUES
CHAPITRE 2: CARACTERISATION DE L’EXPOSITION AU FIPRONIL ET AU FIPRONIL SULFONE PAR VOIE ORALE CHEZ LE RAT
A. PROBLEMATIQUE, HYPOTHESES ET OBJECTIFS
B. EVOLUTION DES CONCENTRATIONS PLASMATIQUES EN FIPRONIL ET EN FIPRONIL SULFONE APRES DES ADMINISTRATIONS REPETEES DE FIPRONIL
1. MATERIELS ET METHODES
a. Plan expérimental
b. Analyse pharmacocinétique
2. RESULTATS
3. CONCLUSION
C. PARAMETRES PHARMACOCINETIQUES DU FIPRONIL ET DU FIPRONIL SULFONE APRES UNE
ADMINISTRATION UNIQUE DE FIPRONIL OU DE FIPRONIL SULFONE
1. MATERIELS ET METHODES
a. Plan expérimental
b. Analyse pharmacocinétique
2. RESULTATS
3. CONCLUSIONS
D. ESSAI DE REDUCTION DE LA BIOTRANSFORMATION DU FIPRONIL EN FIPRONIL SULFONE AVEC UNE DOSE
UNIQUE DE PIPERONYL BUTOXIDE
1. MATERIELS ET METHODES
2. RESULTATS
3. CONCLUSIONS
E. ESSAI DE REDUCTION DE LA BIOTRANSFORMATION DU FIPRONIL EN FIPRONIL SULFONE AVEC DES DOSES CROISSANTES DE PIPERONYL BUTOXIDE
1. MATERIELS ET METHODES
2. RESULTATS
3. CONCLUSIONS
F. DISCUSSION
CHAPITRE 3: TOXICOLOGIE COMPARATIVE DU FIPRONIL ET DU FIPRONIL SULFONE IN VIVO
A. PROBLEMATIQUE, HYPOTHESES ET OBJECTIFS
B. COMPARAISON DES EFFETS PERTURBATEURS THYROÏDIENS D’UN TRAITEMENT AU FIPRONIL OU AU FIPRONIL SULFONE CHEZ LE RAT
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation des solutions d’hormones thyroïdiennes
b. Plan expérimental
c. Fractions subcellulaires et dosages de protéines
d. Activité de conjugaison du 4-nitrophénol par les UGT1A
e. Activité de sulfoconjugaison du 2-naphthol par les SULT conjuguant les phénols
2. RESULTATS
a. Effet du traitement sur le poids des animaux et le poids des foies
b. Concentrations plasmatiques en fipronil et en fipronil sulfone
c. Caractérisation de l’état pseudo-euthyroïdien
d. Effet du traitement sur les paramètres pharmacocinétiques de la T4 totale et de la T4
libre
e. Effet du traitement sur le profil métabolique des hormones thyroïdiennes
f. Effet du traitement sur l’expression des ARNm des Ugt1a1 et des Sult1b1 et sur l’activité des UGT1A et des SULT conjuguant les phénols
C. COMPARAISON DES EFFETS D’UN TRAITEMENT AU FIPRONIL OU AU FIPRONIL SULFONE CHEZ LE RAT SUR L’ACTIVATION DES CYP
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation de la solution d’antipyrine et dosage de l’antipyrine
b. Plan expérimental
c. Fractions subcellulaires et dosages de protéines
d. Expression protéique des CYP3A
2. RESULTATS
a. Effet du traitement sur le poids des animaux et le poids des foies
b. Concentrations plasmatiques en fipronil et en fipronil sulfone
c. Effet du traitement sur les paramètres pharmacocinétiques de l’antipyrine
d. Effet du traitement sur l’expression des ARNm des Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp2b2, Cyp3a1 et Cyp3a2 et sur l’expression protéique des CYP3A
D. DISCUSSION
CHAPITRE 4: TOXICOLOGIE COMPARATIVE D’ESPECE IN VITRO
A. PROBLEMATIQUE, HYPOTHESES ET OBJECTIFS
B. DEVELOPPEMENT SUR HEPATOCYTES DE RAT: DETERMINATION DES CONDITIONS DE MISE EN CULTURE POUR ETUDIER UN EFFET PERTURBATEUR THYROÏDIEN
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation des solutions d’hormones thyroïdiennes
b. Préparation des solutions de fipronil et de fipronil sulfone
c. Plan expérimental
d. In Cell Western
2. RESULTATS
a. Biotransformation du fipronil en fipronil sulfone
b. Effet de la présence ou de l’absence de T3 sur l’expression protéique des CYP3A
c. Effet d’un traitement au fipronil ou au fipronil sulfone sur l’expression protéique des CYP3A
d. Effet perturbateur thyroïdien d’un traitement au fipronil ou au fipronil sulfone
3. CONCLUSIONS
C. DEVELOPPEMENT SUR HEPATOCYTES DE RAT: EFFETS DE L’INHIBITION DE LA BIOTRANSFORMATION DU FIPRONIL EN FIPRONIL SULFONE SUR LA PERTURBATION THYROÏDIENNE
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation des solutions d’hormones thyroïdiennes
b. Préparation des solutions de fipronil, de fipronil sulfone et de piperonyl butoxide
c. Plan expérimental
2. RESULTATS
a. Biotransformation du fipronil en fipronil sulfone
b. Effet perturbateur thyroïdien des différents traitements
3. CONCLUSIONS
D. DIFFERENCES INTERSPECIFIQUES DANS LA PERTURBATION THYROÏDIENNE INDUITE PAR UN
TRAITEMENT AU FIPRONIL OU AU FIPRONIL SULFONE
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation de la solution de thyroxine
b. Préparation des solutions de fipronil et de fipronil sulfone
c. Plan expérimental
d. Test de cytotoxicité
2. RESULTATS
a. Cytotoxicité des différents traitements
b. Biotransformation du fipronil en fipronil sulfone
c. Effet perturbateur thyroïdien d’un traitement au fipronil ou au fipronil sulfone chez les différentes espèces
3. CONCLUSIONS
E. DISCUSSION
CHAPITRE 5: MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PERTURBATION THYROÏDIENNE
ENGENDREE PAR UN TRAITEMENT AU FIPRONIL
A. PROBLEMATIQUE, HYPOTHESES ET OBJECTIFS
B. IMPACT DU FIPRONIL SUR LE TRANSCRIPTOME HEPATIQUE DE RAT
1. MATERIELS ET METHODES
a. Plan expérimental
b. Puces à ADN 1
2. RESULTATS
a. Effet du traitement sur le poids des animaux
b. Concentrations plasmatiques en fipronil et en fipronil sulfone
c. Potentiel perturbateur thyroïdien du fipronil
d. Voies métaboliques hépatiques modulées par le fipronil
3. CONCLUSIONS
C. IMPACT DU FIPRONIL SUR LE TRANSCRIPTOME HEPATIQUE CHEZ LA SOURIS
1. MATERIELS ET METHODES
2. RESULTATS
a. Effet du traitement sur le poids des animaux et le poids des foies
b. Voies métaboliques hépatiques modulées par le fipronil
3. CONCLUSIONS
D. IMPLICATION DES RECEPTEURS NUCLEAIRES CAR ET PXR DANS LA PERTURBATION THYROÏDIENNE
ENGENDREE PAR UN TRAITEMENT AU FIPRONIL
1. MATERIELS ET METHODES
a. Préparation de la solution de C6-LT4
b. Plan expérimental
2. RESULTATS
a. Effet du traitement et du génotype sur le poids des animaux et le poids des foies
b. Concentrations plasmatiques en fipronil et en fipronil sulfone
c. Potentiel perturbateur thyroïdien du fipronil
d. Voies métaboliques hépatiques modulées par le fipronil
3. CONCLUSIONS
E. EFFET D’UNE FORTE DOSE DE FIPRONIL SUR LA REGULATION DE L’EXPRESSION DE GENES HEPATIQUES CHEZ DE JEUNES SOURIS SAUVAGES, CAR-/- ET PXR-/-
1. MATERIELS ET METHODES
2. RESULTATS
a. Effet du traitement et du génotype sur le poids des animaux et le poids des foies
b. Potentiel perturbateur thyroïdien du fipronil
c. Voies métaboliques hépatiques modulées par le fipronil
3. CONCLUSIONS
F. DISCUSSION
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ARTICLE TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VIVO
ERRATUM ARTICLE TOXICOLOGIE COMPARATIVE IN VIVO
REFERENCES