Architecture de puces à ADN fluo rescentes ultrasensibles

Détection par fluorescence

Mécanisme de la fluorescence

La fluorescence est un processus de luminescence permettant à une molécule de passer d’un état électronique excité à un état d’énergie plus basse, par émission de lumière. Plus précisément, la photoluminescence (luminescence induite par absorption de la lumière) est appelée fluorescence ou phosphorescence suivant la nature de l’état excité et la voie de désexcitation (figure 30). Le processus de fluorescence peut être décrit à partir du diagramme de Jablonski (figure 30).13 Pour une molécule donnée, il existe différents états électroniques (état fondamental et états excités) notés S0, S1 et S2 sur le diagramme ci-dessous. Chaque niveau d’énergie d’une molécule est subdivisé en niveaux correspondant aux différentes excitations vibrationnelles et rotationnelles. L’état électronique est dit singulet lorsque le spin total est nul ou triplet lorsque le spin est égal à 1. Dans la très grande majorité des cas, les molécules susceptibles de fluorescer dans le visible possèdent un système d’électrons appariés dans un état singulet où seul l’état vibrationnel v0 est peuplé. Lors de l’absorption d’un photon suffisamment énergétique (dans la bande d’absorption des molécules), les électrons accèdent alors à un niveau d’énergie plus élevé : la molécule se trouve dans un état “ excité”. Les niveaux excités atteints sont par nature instables, la durée de vie de l’état excité est souvent de l’ordre de quelques nanosecondes. Deux types de processus photophysiques permettent à la molécule excitée de dissiper son énergie excédentaire : les processus de désactivation non radiative et les processus de désactivation radiative ou luminescence. Si l’émission radiative se produit entre deux états singulets, le phénomène est appelé fluorescence. Si l’émission se produit entre deux états de multiplicité différente (triplet – singulet), le phénomène est appelé phosphorescence et la durée de vie de l’état excité est généralement plus longue que pour la fluorescence. Le spectre d’émission de fluorescence est en général décalé vers des longueurs d’onde plus grandes que la longueur d’onde d’excitation (les photons émis par fluorescence ayant une énergie plus faible que celle des photons absorbés).Il est possible d’exciter une molécule fluorescente revenue à l’état fondamental plusieurs fois ; ainsi un fluorophore peut émettre des milliers de photons. Ceci explique la très bonne sensibilité des puces à ADN fluorescentes. Il faut cependant éviter d’exposer le fluorophore à une excitation trop longue ou trop intense pour éviter le photoblanchiment, souvent associé à une réaction de l’oxygène avec la molécule dans l’état excité et qui aboutit à une diminution de la fluorescence. La fluorescence peut aussi être affectée par des processus d’extinction lorsque de nouveaux canaux de recombinaison deviennent efficaces, par exemple au voisinage de métaux ou dans certaines configurations où les fluorophores forment des dimères.

Mesure de la fluorescence

 Il existe de nombreux fluorophores organiques permettant de travailler à n’importe quelle longueur d’onde dans le visible. Parmi les fluorophores organiques, les cyanines sont couramment utilisées dans le domaine des puces à ADN. Aussi choisirons-nous de travailler avec les carbocyanines (Cy) Cy3 (λex = 550 nm ; λem = 570 nm) et Cy5 (λex = 650 nm, λem= 670 nm) dont les structures sont données figure 31. Chaque fluorophore est caractérisé par son rendement quantique Φ (nombre de photons émis/ nombre de photons absorbés). Les carbocyanines 3 et 5 ne présentent pas des rendements très élevés (Cy3 = 0,04 et Cy5 = 0,28) 62 mais ont l’avantage de pouvoir être intégrées de façon très contrôlée lors de la synthèse de séquences d’oligonucléotides marqués.14 Figure 31: Structure des carbocyanines 3 et 5. Pour les mesures de fluorescence, nous utilisons deux types de système : – Un scanner commercial Axon instrumentation Personal 4100A (figure 32a). Dans ce cas, les fluorophores sont excités par un laser à la longueur d’onde d’absorption (532 nm pour Cy3 et 635 nm pour Cy5) et l’émission est filtrée par un filtre d’excitation. La fluorescence est détectée en géométrie confocale par un photomultiplicateur (PMT), auquel est appliquée une tension de 350 ou 450 V qui permet d’ajuster le gain pour la mesure de l’intensité du signal. – Un imageur Hyblive, commercialisé par Genewave (figure 32b). Cette machine permet de mesurer des images de fluorescence au cours de la réaction d’hybridation.6,7 Dans ce cas, les fluorophores sont excités par des diodes électroluminescentes et la fluorescence est collectée par un capteur CCD (Charge Coupled Device).

Limite d’utilisation du silicium cristallin

Une première idée pour s’affranchir des limites liées aux procédés d’immobilisation des sondes à la surface est de travailler sur substrat de silicium cristallin, pour lequel des procédés robustes et bien contrôlés de greffage de molécules organiques ont été mis au point. Toutefois, le calcul de l’intensité du champ d’excitation et d’émission pour un fluorophore placé à une distance d (~5 nm) d’un substrat de silicium cristallin (figure 33) révèle certaines limites. Dans le cadre de cette étude nous choisirons d’optimiser les architectures pour la cyanine 5 : nous ferons donc les calculs avec les longueurs d’onde dans le rouge, en utilisant les longueurs d’onde d’excitation (635 nm) et d’émission (670 nm) de la cyanine 5. Le rendement de fluorescence d’une molécule accrochée à une surface dépend de façon critique des indices de réfraction des différents substrats. L’intensité du champ d’excitation est gouvernée par le champ électrique local E du faisceau d’excitation, qui diffère généralement de celui dans l’air en l’absence d’interface E0. En considérant la superposition de l’onde incidente et de l’onde réfléchie, il est possible de déterminer l’intensité du champ d’excitation en incidence quasi-normale (équation 1). Nous pouvons en déduire que pour le silicium (n=3,4 ; kd <<1) E2 ~ 0,2 E0 2 alors que pour le verre nous avons E2 ~ 0,64 E0 2 .