Appareillage

L’appareillage employé pour toutes les manipulations est un appareillage commercial de chromatographie en phase supercritique développé par la société WATERS (Milford, MA, USA). Ce système, nommé Acquity UPC² (Ultra Performance Convergence Chromatography), se compose de 6 modules tous pilotés à l’aide du logiciel Empower 3 et identifié sur la Figure II-1 : Un gestionnaire de solvant binaire composé de deux pompes. L’une est dédiée au pompage du CO2 supercritique (pompe refroidie à 3°C pour garder le fluide dans son état compressé). La seconde pompe est dédiée au co-solvant organique associé au CO2, elle travaille quant à elle à température ambiante (Module n°3)  Afin de maitriser au mieux le système et parvenir à développer une méthode d’analyse, il est nécessaire de caractériser l’appareillage en déterminant le volume de délai.  Ce volume correspond à la somme de tous les volumes (tubes + chambre de mélange) à travers lesquels la phase mobile va cheminer avant d’arriver en tête de colonne. En fonction du débit employé, il faudra donc un temps de délai (proportionnel au volume de délai), avant qu’un changement de phase mobile ne parvienne en tête de colonne.  Pour mesurer ce volume, la colonne d’analyse est remplacée par une union de volume mort égal à 0. A partir de la programmation d’un gradient d’élution adéquat (de 70 à 100 % de co-solvant) et d’un co-solvant contenant un traceur UV, on mesure le temps nécessaire pour arriver au milieu du gradient. Ce temps est équivalent à T = Td + Tg/2 avec Td temps de délai et Tg le temps de gradient.

Dans notre cas, un volume de délai de 525 μL a pu être déterminé. En comparaison aux systèmes UHPLC disponibles actuellement sur le marché, cette valeur semble bien supérieure (environ 100 μL pour UHPLC). Cela s’explique par la nécessité d’avoir une chambre de mélange plus grande (425 μL) afin de parvenir à homogénéiser parfaitement les deux fluides composant la phase mobile. En effet, on cherche ici à mélanger un fluide subcritique (CO2) et un liquide (co-solvant). Afin de ne pas risquer de démixtion de phase et d’assurer un signal avec un bruit de fond minimum, une chambre de mélange supplémentaire est nécessaire. Cela se traduit en pratique par un temps de délai plus long et non négligeable lors de l’élaboration des programmes de gradient pour l’optimisation des méthodes SFC. Au travers des travaux d’optimisation de la méthode SFC pour les matrices ex-biomasse, plusieurs géométries de colonnes ont été testées. Afin de ne comparer que les performances liées aux phases stationnaires et ne pas prendre en compte les effets dus aux changements de dimension entre colonnes, un gradient générique et normalisé a été mis en place. De même, les différents temps de pallier employés dans la méthode ont été normalisés en prenant en compte le temps de délai (Td) et le temps mort (T0). La Figure II-3 présente le profil générique du gradient utilisé. Ainsi, le temps de pallier initial (Tpi), le temps de pallier final (Tpf) et le retour à la composition finale (Ta) sont définis comme suit : L’utilisation de cette normalisation permettra donc de pouvoir comparer les colonnes de géométries différentes sans être impactée par les caractéristiques physiques de ces dernières.

Au cours de ces travaux, plusieurs paramètres ont été optimisés afin de parvenir à la séparation ayant la plus grande capacité de pics. Le Tableau II-1 présente les différentes colonnes qui ont été testées lors de cette optimisation. Le type de phase sélectionnée a été déterminé à l’aide de la littérature et des travaux de West et al.[1] afin de couvrir l’ensemble des interactions offertes par les phases stationnaires. Ainsi les 7 phases stationnaires choisies devraient permettent de couvrir un large domaine de sélectivité afin d’effectuer un screening. En adoptant le même type de représentation que dans cet article, la Figure II-4 représente le positionnement de nos différentes phases stationnaires.  Les paramètres critiques pour optimiser une séparation en SFC sont principalement : la nature des phases mobiles et stationnaires, la BPR, la température, le débit, les conditions de gradient (pente, composition initiale). L’optimisation de ces paramètres fera l’objet du chapitre 3. D’autres paramètres