ANALYSES HISTOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES

ANALYSES HISTOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES

Observation de coupes histologiques

Sur certaines aortes fraîchement prélevées, de petits segments ont été placés dans de la formaline, puis fixés quelques jour après dans de la paraffine, permettant de réaliser ultérieurement des coupes fines (5µm) au microtome (Leica Biosystems RMββγ5). Les coupes obtenues sous forme de ruban ont été placées dans de l’eau distillée à γ7°C afin de délier les coupes, puis elles ont été positionnées sur une lame (Superfrost Ultra Plus, Thermo Scientific). Après avoir été égouttées, les lames ont été placées dans un incubateur à γ7°C toute une nuit afin d’être totalement sèches. Le lendemain, les lames ont été déparaffinées grâce à deux bains successifs d’Histoclear (Fisher Scientific) de 10 minutes, puis réhydratés dans des bains d’alcool à des degrés décroissants (100, 95, 90 puis 75%) de 5 minutes chacun, et pour finir les lames ont été plongées dans de l’eau distillée pendant 5 minutes. Afin de pouvoir observer au microscope la structure morphologique de nos échantillons « aortes + PVAT », les lames ont été colorées à l’hématoxyline-éosine, permettant de faire apparaître les noyaux et le cytoplasme des cellules. ϭϬϮ 6.2. Western Blots 6.β.

Extraction et préparation des échantillons

Lors des sacrifices de rats, certains tissus, aortes et PVAT, ont été rapidement plongés dans de l’azote liquide puis conservés à -80°C afin de figer toute réactions enzymatiques. Les échantillons d’aorte ont été broyés à l’aide d’un potter verre dans un tampon d’extraction SB à 4°C (50mM de Tris-HCl, pH=6.7, 1%SDS, 10% de glycérol), contenant notamment un inhibiteur de protéases (Protease inhibitor cocktail ; Sigma Aldrich) et un inhibiteur de phosphatase (NaOV ; Fisher Scientific). L’homogénat obtenu était ensuite centrifugé à 17 000 g pendant 15 minutes à 4°C, permettant d’obtenir un surnageant ne contenant que des éléments cytosoliques, répartis ensuite en plusieurs aliquots et conservés à – 80°C. Les échantillons de PVAT ont été broyés à l’aide d’un Ultra-Turax (IKA, T10Basic) dans le même tampon d’extraction. L’homogénat obtenu a ensuite été centrifugé à 1β 000g pendant β0 minutes à 4°C, permettant de récupérer l’ensemble des protéines cytosoliques contenues dans le surnageant, et de les conserver en plusieurs aliquots à -80°C. 6.β.β.

Dosage des protèines

L’évaluation de la concentration en protéine des échantillons était réalisées avec un kit de dosage BCA (Bicinchonidic acid)(Pierce® BCA Protein Assay Kit ; Thermo Scientific). Le principe de ce dosage repose sur l’association du BCA aux ions Cu+, obtenus par la réduction d’ion Cuβ+ par les protéines présentes dans l’échantillon. Le complexe BCA-Cu+ présente une forte absorbance à 56βnm, proportionnelle à la concentration protéique de l’échantillon. Ainsi, grâce à une gamme étalon BSA (Bovine Serum Albumin) de concentration protéique connue (de 0 à βg/ml), la concentration en protéine de chaque échantillon a été mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 56βnm.

Western Immunoblotting

La technique du Western Blot permet de mesurer le niveau d’expression d’une protéine d’intérêt dans un échantillon donné. Grâce à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les protéines sont séparées en fonction de leur poids moléculaire, leur différence de charge ayant été annihilée par le dodécylsulfate de sodium (SDS) présent dans le tampon SB décrit plus haut. A chaque échantillon était ajouté une solution de ȕ- ϭϬϯ mercaptoéthanol (5%) permettant de dénaturer les protéines, ainsi que du bleu de Bromophénol (0.β%) apportant une certaine densité à l’échantillon nécessaire à sa migration le long du gel. Les échantillons étaient ensuite placés au bain-marie à 95°C afin de dénaturer complètement les complexes protéiques. Finalement, les échantillons étaient déposés sur le gel, en prenant soin de normaliser la quantité de protéine présente dans chacun d’eux. Un marqueur de poids moléculaire était également déposé sur le gel (EZ-Run TM Pre-Stained Rec Protein Ladder ; Fisher Scientific). Une fois la migration terminée, les protéines sont transférées sur une membrane de Polyfluorure de vinylidène (PVDF) à l’aide d’un appareil de transblot (Bio-Ras transfert apparatus ; Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ca). Les membranes étaient incubées sous-agitation, à température ambiante pendant 1 heure, dans une solution de blocage (lait 10% ou BSA γ%) préparée avec du TBS-T (TrisBuffered saline, 0.05% Tween β0, pH=7.5), afin de saturer les sites non spécifiques. Une fois cette étape terminée, les membranes étaient rincées avec du TBS-T, puis incubées toute une nuit sous-agitation et à 4°C, avec l’anticorps spécifique de la protéine d’intérêt (anticorps primaire) (Tableau 4).  Tableau 4 : Liste des anticorps utilisés en Western Blot au cours de ce travail. Au terme de l’incubation avec l’anticorps primaire, les membranes étaient rincées avec du TBS-T, puis incubées pendant 1 heure avec un anticorps secondaire, à température ambiante. Les membranes étaient à nouveau rincées puis immergées dans un réactif luminescent ECL (enhanced chemiluminescent) ou ECL+ (SuperSignal® West Pico Chemiluminescence Substrate), qui au contact de l’enzyme HRP, contenu dans l’anticorps secondaire, produit une émission photonique. L’intensité de la réaction de chimiluminescence est alors détectée sur un film radiographique, qui sera scanné et permettra de quantifier l’intensité du signal grâce au logiciel Image J (ImageJ, NIH, USA). Le niveau d’expression des protéines étudiées a été normalisé par le niveau d’expression de la GAPDH ou de la Tubuline, utilisés comme ϭϬϰ protéines de référence puisque leur expression n’était pas altérée par les différentes conditions (régime enrichi ou protocole d’entrainement). Pour certaines expérimentations, le rouge ponceau a été utilisé comme contrôle de charge protéique. 

Evaluation du profil des adipokines sécrétées par le tissu adipeux périvasculaire (Proteome Profiler TM, RnDSystems)

Ce kit a été utilisé afin d’évaluer l’impact de nos conditions expérimentales sur le profil des adipokines sécrétées par le PVAT. Cette technique permet de mesurer l’expression protéique de différentes cytokines sélectionnées, grâce à une membrane en nitrocellulose (Rat Adipokine Array, RnDSystems, 89γ907) où ont été préalablement positionnés des anticorps spécifiques de ces cytokines (anticorps primaires). Un cocktail d’anticorps secondaires (RnDSystems, 89γ908) est prévu pour être mélangé aux échantillons testés. Les membranes doivent être immergées dans une solution de blocage (Array Buffer 6, RnDSystems, 89γ57γ), avant d’être placées dans une cassette avec le complexe échantillon/cocktail d’anticorps secondaires. Grâce à une incubation d’1 nuit sous agitation, les cytokines présentes dans l’échantillon vont balayer la membrane et se fixer sur leur anticorps spécifiques. Les membranes sont ensuite rincées puis incubées avec une solution de Streptavidin-HRP (RnDSystems, 89γ019) pendant γ0 minutes. A la fin de l’incubation les membranes sont à nouveau rincées puis elles sont immergées dans une solution de révélation (Chemi Reagent 1 et β, RnDSystems, 894β87, 894β88) avant d’être placées sous un film plastique et mise au contact d’un film radiographique. Afin de normaliser un minimum la quantification protéique de nos échantillons, des échantillons de deux individus de chaque groupe ont été mélangés puis incubés avec les membranes. Les mesures ont été réalisées deux fois.