Analyse des souspopulation

Analyse des sous population

Souches et conditions de culture

Les souches de P. luminescens (TT01, phoP et pbgE) sont cultivées à 28°C en LB. Le mutant phoP (Table 1 annexe) a été construit par Derzelle et al 2004. Le mutant pbgE, quant à lui a été construit par clarke et al 2005 et il est décrit en annexe table 1. Quand nécessaire les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes, polymyxine B 100 µg/mL, ciprofloxacine 1 µg/mL. Détermination de la concentration minimale inhibitrice Les CMI sont réalisées en plaque 96 puits avec une contenance maximale de 200 µL par puits. On dépose dans tous les puits 100 µL de LB, la polymyxine B est ajouté dans le premier puits (100 µL) à une concentration finale de 250 µg/mL, la colistine à 20 mg/mL, les cécropines A et B et la cécropine A isolée à partir de Spodoptera frugiperda à 50 µg/mL, et diluée en cascade de puits en puits par un facteur deux. Les souches de Photorhabdus et Xenorhabdus sont ensemencées au 1/25 et mises en culture dans du LB à 28°C jusqu’à ce que la culture atteignent une DO comprise entre 0,6-0,8. Puis les cultures sont diluées par 1000 dans du LB et 100 µL sont ajoutés à chaque puits de la plaque. Les plaques sont mises à pousser à 28°C et le résultat est contrôlé à 24 et 48 heures. Seuls les résultats à 48 heures sont indiqués ici. La CMI correspond à la concentration en CAMPs contenue dans le dernier puits ayant permis une croissance de la bactérie. Antibiogrammes Les souches de Photorhabdus et Xenorhabdus sont ensemencées au 1/25 et mises en culture dans du LB à 28°C jusqu’à ce que les cultures atteignent une DO comprise entre 0,6 et 0,8. Puis les cultures sont diluées par 1000 en Mueller Hinton dans un volume final de 1 mL. Des boites de Petri contenant du Mueller Hinton Agar (Biokar) sont inondées avec les 1 mL de la dilution au 1000ème et laissées reposer 5 minutes puis l’excédent est enlevé. Ensuite, deux disques de papiers stériles non imprégnés sont déposés sur les boites à distance suffisante du bord et du deuxième disque. 10 µL de 48 la solution mère de polymyxine B (50 mg/mL) sont déposés sur le premier disque et 10 µL de polymyxine B diluée au 10ème sont déposés sur le second disque correspondant respectivement à 500 µg et 50 µg de polymyxine B finale. Les boites sont incubées 48 heures à 28°C. Evaluation du pourcentage de bactéries résistantes par CFU Les souches de Photorhabdus et Xenorhabdus sont cultivées en LB à 28°C jusqu’à une DO comprise entre 0,6 et 0,8. Une aliquote de culture est prélevée, lavée une fois en PBS (sans Ca2+ sans Mg2+) et diluée en LB. 100 µL de la dilution souhaitée est étalée sur gélose nutritive (GNO) avec et sans polymyxine B 100 µg/mL. Les boites sont ensuite incubées à 28°C. Au bout de 48 heures le nombre de colonies sur chaque boite est comptabilisé et le pourcentage de résistance est évalué en divisant le nombre de colonies dénombrées sur gélose nutritive (GNO) + polymyxine B divisé par le nombre de colonies dénombrées sur GNO, le tout multiplié par 100. Evaluation du pourcentage de bactéries persistantes dans la population. La souche P. luminescens TT01 a été ensemencée au 1/100ème dans du LB. En phase exponentielle (DO entre 0,7 et 0,8), un échantillon est prélevé, lavé dans du PBS (sans Mg2+ sans Ca2+) et étalé sur boite LB-Agar + pyruvate 0,1% et LB-Agar, pyruvate 0,1% et ciprofloxacine 2mg/mL (Somvanshi et al. 2012), ceci nous permettra d’avoir la valeur de référence du nombre de bactéries dans le milieu. Puis la ciprofloxacine est ajoutée à une concentration finale de 1µg/mL. Une aliquote est prélevée toutes les 30 minutes pendant 3 heures et étalée sur milieu LBA-pyruvate 0,1% et LBA-pyruvate 0,1%- ciprofloxacine 2 mg/mL. Les boites sont comptabilisées après 48 heures d’incubation. Le rapport du nombre de bactéries poussant sur LBA-pyruvate 0,1% après et avant l’ajout de la ciprofloxacine dans le milieu permet d’obtenir le pourcentage de bactéries persistantes. Ces expériences ont été réalisées en triplicats. Bioessais de pathologie chez l’insecte Les larves de Spodoptera littoralis sont élevées avec une photopériode de 12 heures sur un milieu artificiel à 24°C. Les stades larvaires L5 ont été sélectionnés pour les bio-essais et stérilisés dans de l’éthanol 70% (v/v) avant injection. Grâce à une seringue Hamilton des groupes de 20 larves sont injectés avec 103 CFU de bactéries en phase exponentielle de croissance dans un volume total de 20 µL. Les larves ainsi injectées ont été incubées pendant plus de 96 heures et la mortalité des insectes est dénombrée au cours du temps. Travaux réalisés par injection directe dans l’insecte Spodoptera littoralis (noctuelle) dans le cadre de la thèse de Z. Abi Khattar (Abi Khattar 2009).

Mise en évidence de la sous population résistante

La première étape de ce travail de thèse a tout d’abord été de reconfirmer les précédents résultats obtenus avec P. luminescens TT01 et de les enrichir avec de nouvelles souches. Ainsi, la concentration minimale inhibitrice de CAMPs a été évaluée sur la souche sauvage TT01 ainsi que sur deux mutants phoP et pbgE impliqués dans la modification du LPS par ajout d’un amino-arabinose au niveau du core du lipide A entrainant une modification globale de la charge bactérienne de négative à positive (Guo et al. 1997). Plusieurs CAMPs ont été testés : ceux existant chez les insectes comme les cécropines A et B (SIGMA) et de S. frugiperda et ceux produits par des bactéries comme la polymyxine B et la colistine (polymyxine E). Les CMIs envers les CAMPs ont été évalués (tableau 1). La souche sauvage TT01 résiste à de très fortes concentrations (>125 µg/mL) de polymyxine B et les valeurs de résistance sont également élevées pour les autres CAMPs, alors que le mutant phoP voit sa croissance inhibée dès 1-3 µg/mL de polymyxine B ce qui en fait un mutant hypersensible. Il en est de même pour le mutant pbgE qui est inhibé entre 0,2 et 0,5 µg/mL de polymyxine B. Le profil est similaire pour les autres CAMPs, la souche sauvage est résistante à de très fortes doses et les mutants sont inhibés à de très faibles doses. La polymyxine B est un cyclopeptide cationique produit par la bactérie Bacillus polymyxa. La société française de microbiologie (SFM) a estimé que les bactéries à croissance rapide, parmi lesquelles on trouve les entérobactéries, étaient inhibées dès des concentrations de 2 µg/mL (Abi Khattar 2009), ce qui fait de TT01 une souche particulièrement résistante (plus de 75 fois plus résistante) alors que les mutants sont bien, quant à eux, dans la zone de sensibilité. Ces résultats confirment également les premiers résultats du laboratoire (Abi Khattar 2009 ; Pagès Sylvie). A la vue de ces résultats la souche sauvage TT01 apparait comme résistante, les mutants comme sensible (pbgE) ou à la limite (phoP) mais rien ne laissait supposer que la population de TT01 puisse être hétérogène. Cependant, lorsque l’on réalise des antibiogrammes sur ces mêmes souches (figure 19 et article 2) on peut voir que le profil de résistance de la population sauvage est hétérogène et non pas homogène. En diffusant dans la gélose, la polymyxine B crée un gradient de concentration qui permet d’évaluer la résistance ou la sensibilité d’une bactérie envers un antibiotique. Pour la souche sauvage, quelques clones sont capables de pousser dans le halo d’inhibition de croissance de la polymyxine B. Cela signifie que seuls quelques clones sont réellement résistants à la polymyxine B alors que la majeure partie apparaît sensible. Pour les deux mutants sensibles phoP et pbgE, aucun clone n’est capable de Figure 19 : Présence de deux sous-populations chez la souche sauvage TT01. Dans le cercle rouge : clone capable de pousser en présence de polymyxine B. Les quantités sur les figures correspondent à la dose de polymyxine B déposée sur le filtre au centre du halo.