Analyse de la production du superoxyde in cellulo

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La NRH : quinone réductase 2 (QR2)

En 1997 Talalay et son équipe révélèrent que la flavoprotéine purifiée à partir de reins bovins par Shutsung Liao et H.G. Williams-Asham (Liao S., 1961) dans les années 1960 était un homologue de QR1 et la renommèrent QR2 pour NRH:quinone réductase 2 Zhao( Q., 1997). QR2 est plus ou moins exprimée dans de nombreux tissus. Elle est fortement retrouvée au niveau des poumons, du foie, des muscles squelettiques et des reins (Van der Hauwaert C., 2015), de façon plus modérée dans le cœur et le cerveau et plus faiblement dans le placenta (Jaiswal A.K., 1994).

Structure génétique et protéique

L’ADNc de la forme humaine de QR2 et la protéine ont respectivement 54 et 49% d’homologie de séquence avec la forme humaine d’ADNc de QR1 et la protéine Jaiswal( A.K., 1990). Le gène codant pour la protéine QR2 se situe sur le chromosome 6p25 et est très polymorphique (Jaiswal A.K., 1999). Ce gène d’une longueur de 20 kb comporte sept exons interrompus par six introns. Les exons trois à six sont très conservés. L’analyse nucléotidique de la séquence du promoteur du gène de QR2 contient une TATA box imparfaite, deux copies de CAT box, quatre copies du motif Sp1, une copie d’élément de réponse aux électrophiles (EpRE) et trois copies d’éléments de réponse aux xénobiotiques (XRE)Long( II D.J., 2000). L’expression du gène de QR2 est donc, comme QR1, induite en réponse à des xénobiotiques et à des antioxydants. En réponse à une stimulation par des antioxydants, des xénobiotiques, des ultra-violets et des radiations, le facteur nucléaire NF-E2-related (Nrf2) quitte le cytoplasme pour se fixer à l’EpRE nucléaire, permettant de réguler l’expression et de coordonner l’induction de toute une série de gènes encodant pour des protéines détoxifiantes ou chémo préventives dont QR1 et QR2(Jaiswal A.K., 2004 ; Wang W., 2006).

Tout comme QR1, QR2 se présente sous la forme d’une structure homodimérique mais ne contient que 231 acides aminés (25 956 Da) par monomère (Figure 6) alors que QR1 en contient 274. Ainsi, la protéine comporte quarante-trois acides aminés de moins que QR1 au niveau de la région C-terminale. La Figure 7 ci-dessous présente les séquences protéiques des formes humaines des protéines QR1 et QR2.
L’acquisition des données cristallographiques de l’holoenzyme QR2, seule ou co-cristallisée en présence de différents ligands, met en évidence une structure homodimérique très imbriquée, impliquant plus de 264 contacts entre monomères inférieurs à quatre Å. Situés de part et d’autre de l’interface dimérique, deux sites actifs indépendants décrivent une cavité constituée de résidus issus de chaque monomère, assurant l’ancrage non covalent d’une molécule de groupement prosthétique FAD1. A l’échelle monomérique, les 220 premiers résidus constituent le domaine catalytique comme chez QR1. La protéine contient des sites très conservés de modification co et post traductionnelle (glycosylation, myristoylation cryptique) et des sites de fixation de la protéine kinase C et de la caséine kinase II absents chez QR1 (Long II D.J., 2000).
Ce site présente de nombreuses substitutions chez QR2. En effet, la coupure C-terminale de quarante-trois résidus chez QR2 affecte la liaison à la partie adénine dinucléotide phosphate du NAD(P)H 8 ne permettant alors qu’une interaction avec les nicotinamides N-substitués de façon simple dont le N-ribosyl-dihydronicotinamide 16.

Site catalytique de fixation à la quinone

La fixation de la quinone chez QR2 se produit de la même façon que chez QR1 (Figure 8). La quinone se place entre le noyau isoalloxazine du FAD et la chaîne latérale de la phénylalanine F178. D’autres résidus participent à cette liaison à la quinone de façon non spécifique (phénylalanine F106, tryptophane W105, phénylalanine F126, asparagine N161). Une des différences entre QR1 est QR2 est liée au remplacement des deux tyrosines Y126 et Y128 de QR1 par la phénylalanine F126 et l’isoleucine I128, rendant la cavité catalytique plus large et hydrophobe chez QR2.
Figure 8. Fixation des substrats au niveau des sites actifs de QR1 et QR2. (A) Fixation de la duroquinone (en bleu) empilée sur le FAD (en jaune) de QR1. (B) Fixation de la ménadione à QR2 similaire à celle de QR1. Les mêmes chaines des deux monomères contribuant à la fixation sont illustrées de couleur différente Bianchet( M.A., 2008).

Site de fixation au métal

Contrairement à QR1, dont le domaine C-terminal forme une structure en épingle, les douze résidus C-terminaux de QR2 s’organisent en une boucle bien définie (Figure 9). Cette boucle peut assurer la coordination d’un atome de métal, probablement un zinc, en surface via les deux histidines H173 et H177 (N), la cystéine C222 (S) et la chaîne carbonyle de cette cystéine (géométrie de tétraèdre déformé)Foster( C.E., 1999 et 2000 ; Antoine M., 2012).
Figure 9. Comparaison des structures cristallographiques de QR1 murine (A et B) et QR2 humaine (C et D). Le domaine C-terminal de QR1 est bien visualisable en haut de la figure B en noir alors qu’il est réduit chez QR2 (D) et proche de l’atome métallique représenté par la sphère noire (Foster C.E., 2000).

Mécanisme d’action

Le mécanisme catalytique en « ping-pong » de réduction des quinones, décrit précédemment pour QR1 au paragraphe 2.1.3,. est applicable à QR2, le même site étant utilisé pour le substrat et le co-substrat. La différence provient de la non conservation de l’histidine H161 qui est remplacée par une asparagine interagissant avec une molécule d’eau et qui joue alors le même rôle de catalyseur acide/base vis-à-vis de la tyrosine Y155 et de l’hydroquinolate.
Cependant, contrairement à QR1 ( Liao S., 1961), QR2 utilise des dérivés nicotinamidiques non phosphorylés comme donneurs d’électrons dont leN-ribosyl-dihydronicotinamide (NRH, 16) (KM= 28 ± 2 µM et k cat = 2600 ± 300 min -1), le N-méthyl-nicotinamide (NMN, 17) ou le co-substrat synthétique 1-benzyl-1,4-dihydro-nicotinamide (BNAH, 18) pour la réduction des quinones en hydroquinones plutôt que le NAD(P)H 8 (KM et kcat respectivement de 252 mM et 156 min-1), ceci signifie que l’activité catalytique de QR2 ne peut pas se mesurer en présence de NAD(P)H (Wu K., 1997).

Le NRH 16 est un produit de la dégradation du nicotinamide mononucléotide réduit (NMNH, 19) par des phosphatases ou du NAD alors que le NMNH proviendrait également de la dégradation du NAD par des hydrolases nicotinamidiques nucléotidiques et des ADP ribosyl transférases, ces deux co-substrats possédant une plus petite taille comparativement au NAD (Liao S., 1962 ; Baum C.L., 1982 ; Zhao Q., 1997).
QR2 peut réduire les substrats « classiques » de QR1 tels que dichlorophénol indolphénol (DCPIP, 20) et la ménadione21 mais de manière beaucoup moins efficace. Elle est cependant onze fois plus active sur l’acide diméthylamino-4-phénylazo-2-benzoïque ou rouge de méthyle 22 qui subit une réduction à quatre électrons (Wu K., 1997). Ceci souligne la capacité de QR2 à réaliser des réductions à deux et quatre électrons.
Par ailleurs, contrairement à QR1, QR2 est la seule nitroréductase décrite chez l’homme (Figure 10) et est capable de réduire le 5-(1-aziridinyl)-2,4-dinitrobenzamide (CB1954, une pro-drogue anticancéreuse, 23). Cette action réductrice, qui est 3000 fois plus efficace (en terme de kcat/KM) chez QR2, semble être due à la tyrosine Y 104 présente chez la forme humaine de QR2 et la forme murine de QR1 mais remplacée par une glutamine dans la forme humaine de QR1 (Wu K., 1997 ; Chen S., 2000).
Figure 10. Mécanisme supposé de la réduction par deux fois deux électrons du groupement nitro en position 4 de la pro-drogue CB1954 par la forme humaine de QR2 (hQR2) ou la forme murine de QR1 (mQR1) en présence de deux molécules de co-substrat NRH (AbuKhader M., 2005).
La présence d’un métal pourrait également participer, au niveau du site actif, au transfert électronique comme dans le cas des cytochromes (Foster C.E., 1999). Cependant, il a été démontré que l’ajout d’un chélateur tel que l’EDTA n’avait aucune incidence sur l’activité enzymatique de QR2 probablement car le zinc fait partie de la structure (il est profondément
enfoncé dans la protéine et donc difficilement échangeable)Kwiek( J.J., 2004).

Modulateurs6 de l’activité de QR2

L’identification d’inhibiteurs efficaces de QR2, c’est-à-dire d’inhibiteurs dont la CI 50 est atteinte à des concentrations non toxiques de l’ordre du nanomolaire, est essentielle à la compréhension du rôle de cette enzyme. Contrairement à QR1, QR2 est résistante à l’inhibition par le dicoumarol 9, le bleu cibacron 10 et la phenindone 11 (Chen S., 2000). Ceci s’explique par le fait que la tyrosine en position 128, dont le phénol est indispensable à l’interaction entre le dicoumarol et l’enzyme via une liaison- est remplacée chez QR2 par une isoleucine ne permettant pas ce type d’interaction (Foster C.E., 2000).
Des essais enzymatiques, d’affinité et de cristallographie par rayons X ont mis en évidence l’effet inhibiteur de quinolines antimalariques (chloroquine 24, quinacrine 25 et primaquine 26) (Kwiek J.J, 2004), du resvératrol 27 (Buryanovskyy L., 2004) et de son métabolite le picéatannol 28 (Hsieh T.C., 2013), de la mélatonine 29 (Pegan S.D. ; 2011) et d’analogues synthétiques tels que le N-(2-(2-methoxy-6H-dipyrido(2,3-a-3,2-e)pyrrolizin-11-yl)ethyl)-2-furamide 30 (NMDPEF ou S29434) (Ferry G., 2010), de flavonoides (tels que le chrysoériol 31) (Boutin J.A., 2005), d’anti-cancéreux comme l’imatinib 32 (Winger J.A., 2009) et certaines imidazoacridin-6-ones (NSC660841, 33) (Nolan K.A., 2010) (Tableau 1).
Ces essais ont également démontré que la capacité d’inhibition de ces molécules est liée à l’état d’oxydation de l’enzyme mais également au couple substrat/co-substrat utilisé.

Rôles de QR2

QR2 est présente de façon ubiquitaire et est expriméeau niveau des reins, des muscles, des poumons, du foie, du cœur et, de façon plus minime, dans le cerveau, le pancréas et les hématies où QR1 n’est pas exprimée Long( II D.J., 2000 ; Graves P.R., 2002). Alors que le rôle de détoxification des quinones par QR1 est décrit et déterminé, de nombreuses questions restent en suspens concernant le rôle de QR2 in vivo.

Réduction des quinones

D’un point de vue fonctionnel, la reconnaissance de l’ubiquinone 12 et de la phylloquinone (vitamine K1, 6) comme substrat suppose que QR2 soit impliqué in vivo dans le contrôle du statut redox de la chaine respiratoire mitochondriale et de la coagulation sanguine. En effet, l’ubiquinone 12 est un relayeur crucial d’électrons au sein des crêtes mitochondriales, tantôt accepteur (complexes I et II) sous sa forme oxydée tantôt donneur (complexe III) sous sa forme réduite (Beyer R.E., 1996). La vitamine K1 est un co-facteur de l’enzyme-carboxylase assurant l’activation des facteurs de coagulation II, VII, IX, X par carboxylation de résidus glutamate clés Kwiek( J.J., 2004).
Différentes quinones ont été étudiées en tant que substrat de QR2, en majorité despara-quinones comme la ménadione 21 et les coenzymes Q0 et Q2 (Boutin J.A., 2005). Cependant, d’autres types de quinones, dont les ortho- ou catechol-quinones semblent pouvoir également être réduites par QR2, des études ayant identifié une activité de QR2 sur des œstrogènes ortho-quinones 34 (Gaikwad N.W., 2009), des ortho et para-quinone méthide (Kucera H.R., 2013) ainsi qu’avec l’adrénochrome 35 (Fu Y., 2008) et la dopamine quinone notamment au niveau de la rétine (Sampaio L. de F., 2014). L’activité catéchol quinone réductase de QR2 justifierait son intervention dans la régulation des produits d’oxydation de nombreux neurotransmetteurs. Ce comportement a déjà été fortement étudié et démontré pour QR1 Graumann( R., 2002 ; Baez S., 1995 ; Arrigada C., 2004). On note que l’étude de la réduction d’ortho-quinones par QR2 est peu rapportée dans la littérature. Cet aspect sera un point d’étude dans ce mémoire.

QR2 comme site de fixation de la mélatonine

La mélatonine 29 est une hormone synthétisée par la glande pinéale au niveau du système nerveux central. Cette hormone est responsable de la régulation du rythme circadien mais possède également une action antioxydante et agit en se fixant aux récepteurs membranaires de la mélatonine de type 1 (MT1) et de type 2 (MT2).
En 2000, l’équipe de Jean Boutin et al. est parvenue à purifier par chromatographie d’affinité et à caractériser par spectrométrie de masse un troisième site de fixation de la mélatonine MT3 dans des tissus de hamster. Ils ont également démontré chez le hamster que MT3 correspondait à l’homologue de la NRH:quinone réductase 2 (Nosjean O., 2000). QR2 peut lier la mélatonine sur deux de ses sites, parmi lesquels son site actif, alors que QR1 ne peut pas fixer la mélatonine. Ce site est donc fortement différent des autres récepteurs à la mélatonine MT1 et MT2 qui sont tous deux des récepteurs membranaires couplés à une protéine G, de plus forte affinité pour la mélatonine que MT3. Une autre étude a confirmé cette hypothèse en démontrant que des souris invalidées pour QR2 n’effectuent aucune fixation de la mélatonine de type MT3 (Mailliet F., 2004). Il a été mis en évidence que la mélatonine était un bon ligand de QR2 (de l’ordre du nM) Boutin( J.A., 2008) mais n’exerçait qu’une faible activité inhibitrice (voir paragraphe 2.2.3).

Polymorphisme de QR2 et pathologies associées

Le polymorphisme génétique de QR2, touche le plus souvent 16 à 29 paires de bases au niveau de la région riche en guanine et cytosine (GC) du promoteur de QR2, entrainant des conséquences physiologiques variées dont de nombreux cancers et désordres neurologiques (Harada S., 2001). Contrairement à QR1, ces pathologies ne sont pas uniquement dues à une diminution de la production de QR2 mais parfois à une plus forte expression de l’enzyme si la délétion affecte le site promoteur Sp3 (Figure 11) ayant pour rôle de restreindre la transcription du gène de QR2 (Wang W., 2004).
La diminution de la production de QR2 ou la production d’enzyme inactive conduit généralement à des effets délétères parmi lesquels une augmentation de la sensibilité à des cancers variés(Clairmont A., 1999) dont les leucémies(Krajinovic M., 2002), le cancer colorectal (Takagi S., 2002), le cancer hépatique (Strassburg A., 2002) et le cancer gastrique (Zhang J.H., 2003), une plus grande sensibilité à la toxicité de certains produits chimiques (Bergamaschi E., 2001 ; Smith M.T., 1999) et de médicaments(Fleming R.A., 2002).
Figure 11. Polymorphisme des séquences du promoteur répresseur (Sp3) ou activateur (Sp1) de la transcription de QR2 et conséquences sur l’expression du gène. (A) séquence de la région promotrice et ses des différents polymorphismes avec les zones de fixation du promoteur Sp3 (en rouge). (B) conséquence du polymorphisme et de la fixation des promoteurs sur l’expression, plus ou moins forte, de QR2 (d’après Wang W., 2008).
D’autre part, une plus forte expression de QR2 présente un effet protecteur vis-à-vis du cancer mammaire. Ceci peut s’expliquer par l’activité réductrice de l’enzyme sur les quinones œstrogéniques 31 ainsi que par la stabilisation du suppresseur de tumeur p53 (Yu K.D., 2009). Le facteur p53 est reconnu comme un élément clé du contrôle de la croissance cellulaire car il est responsable de l’apoptose et de l’arrêt du cycle cellulaire en cas de stress et est fréquemment muté ou absent dans de nombreux types de cancers Pietsch( E.C., 2006 ; Sun Y., 2006). En interagissant directement avec ce facteur, QR2 jouerait un rôle de stabilisateur de p53 et empêcherait sa dégradation par le protéasome 20S suite à un stress causé par l’exposition à des radiations ou à certaines molécules à la fois in vitro et in vivo (Gong X., 2007 ; Iskander K., 2009). QR2 entrerait également en compétition avec le protéasome 20S en se fixant et protégeant le facteur de différenciation myéloïde, C/EBP (CAAT/ enhancer binding protein) impliqué dans la régulation de l’hématopoïèse, ayant pour conséquence une protection de ce dernier contre les radiations et les pathologies myéloprolifératives associée sin vivo (Xu J., 2013). Diverses études ont rapporté l’association entre les polymorphismes touchant, par insertion/délétion (I/D), les sites de fixation du répresseur transcriptionnel Sp3 et de l’activateur d’expression Sp1 de QR2 et des troubles neurologiques tels que la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Ces études ont démontré que ces polymorphismes sont fréquemment retrouvés chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Cependant, les effets de ces polymorphismes sur la production de l’enzyme sont contradictoires, une première étude ayant montré une diminution de l’ARNm de QR2 chez les porteurs hétérozygotes ou homozygotes pour l’allèle D29 Harada( S., 2001) alors qu’une autre étude a montré une plus forte production de l’ARNm et de l’activité de QR2 sur des lignées cellulaires I16/I16 et D29. Cette étude a également révélé que des cellules catécholaminergiques surexprimant QR2 induisaient une plus forte production d’espèces réactives de l’oxygène ou ROS (Wang W., 2008). Ces associations restent toutefois à confirmer car une autre étude réalisée aux Etats-Unis n’a pu démontrer un lien entre QR2 et la maladie de Parkinson (Okada S., 2005). Des études d’hybridation sur puce à ADN montrent une suractivation transcriptionnelle du gène QR2 dans l’hippocampe de rats présentant des troubles de la mémoire liés à l’âge ou induits par la scopolamine tandis que l’invalidation du gène par knock out (KO) ou un traitement par inhibiteur de QR2 (S29434 30 et S26695) maintient les facultés cognitives (Brouillette J., 2008 ; Benoit C.E., 2010). Il semblerait également y avoir une surexpression de QR2 dans l’hippocampe de patients atteints de la maladie d’Alzheimer (Hashimoto T., 2011).

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 – Revue bibliographique
1. La NAD(P)H : quinone réductase 1 (QR1)
1.1. Structure
1.2. Particularités
1.3. Mécanisme d’action
1.4. Détoxification des quinones
1.5. Rôle de QR1 dans l’équilibre redox cellulaire
1.6. Bioactivation de molécules bioréductibles
2. La NRH:quinone réductase 2 (QR2)
2.1. Structure génétique et protéique
2.2. Mécanisme d’action
2.3. Modulateurs de l’activité de QR2
2.4. Rôles de QR2
a) Réduction des quinones
b) QR2 comme site de fixation de la mélatonine
c) Polymorphisme de QR2 et pathologies associées
d) Rôle de QR2 dans l’équilibre redox cellulaire
Chapitre 2 –Étude des substrats, modulateurs et inhibiteurs de QR2
Introduction
1. Activité enzymatique de QR2
1.1. Détermination de l’activité spécifique de QR2
1.2. Détermination du KM de différents substrats de QR2
2. Potentiels redox des substrats de QR1 et QR2
3. Étude de la production d’espèces réactives de l’oxygène liée à la métabolisation des substrats de QR2
3.1. Para-quinones substrats de QR1 et QR2
3.2. Pseudo-quinones substrats de QR2
3.3. Ortho-quinones substrats de QR1 et QR2
3.4. Polyphénols modulateurs de QR2
3.5. Comparaison de l’intensité de production totale d’espèces réactives de l’oxygène après métabolisation des différents substrats par QR2
Conclusion
Chapitre 3 – Détermination des activités de QR1 et QR2 in cellulo
Introduction
1. Réduction des substrats par des lignées cellulaires surexprimant ou non QR1 et QR2
1.1. Cellules CHO-k1-NT
1.2. Cellules CHO-k1-QR1
1.3. Cellules CHO-k1-QR2
1.4. Effet des inhibiteurs et modulateurs sur la réduction des substrats pour les CHO-k1- QR1 et CHO-k1-QR2
1.4.1.Effet des inhibiteurs spécifiques de QR1 et QR2 sur la réduction des substrats pour les CHO k1-QR1 et CHO-k1-QR2
1.4.2.Effet des modulateurs de QR2 sur la réduction des substrats pour les CHO-k1-QR2
2. Production des espèces réactives de l’oxygène par des lignées cellulaires surexprimant ou non QR1 et QR2
2.1. Métabolisation des para-quinones par les lignées cellulaires CHO-k1-NT, CHO-k1- QR1 et CHO-k1-QR2
2.2. Métabolisation des ortho-quinones par les lignées cellulaires CHO-k1-NT, CHO-k1- QR1 et CHO-k1-QR2
3. Production des espèces réactives de l’oxygène par une lignée cellulaire surexprimant naturellement QR2
4. Visualisation et localisation de la production d’espèces réactives de l’oxygène par des lignées cellulaires surexprimant ou non QR1 et QR2
Conclusion
Chapitre 4 – Analyse de la production du superoxyde in cellulo
Introduction
1. Principe de la quantification in cellulo du radical superoxyde
2. Mesure de l’oxydation du dihydroéthidium par screening
3. Identification et quantification des dérivés de l’oxydation du dihydroéthidium
Conclusion
Conclusion générale et perspectives
Partie expérimentale
1. Matériel
1.1. Préparation de l’enzyme purifiée
1.2. Souches cellulaires utilisées
2. Méthodes
2.1. Activité enzymatique et calcul de Vmax et KM
2.1.1. Préparation des solutions
2.1.2.Distribution sur plaque 96 puits
2.1.3.Mesure de fluorescence
2.1.4.Analyse des données cinétiques
vi 2.2. Méthode voltammétrie cyclique
2.3. Expériences de résonance paramagnétique électronique sur enzyme purifiée et sur cellules
2.3.1. Préparation des solutions
2.3.2.Traitement par les inhibiteurs
2.3.3. Préparation des solutions d’analyse d’enzyme purifiée
2.3.4. Préparation des solutions d’analyse des cellules
2.3.5.Conditions d’enregistrement des spectres RPE
2.3.6.Analyse des données RPE sur cellules
2.4. Méthode spectrophotométrie UV-visible (sonde redox Fe3+/Fe2+)
2.4.1.Ensemencement des cellules
2.4.2.Traitement par les inhibiteurs et modulateurs
2.4.3.Traitement par les réactifs
2.4.4.Mesure UV-visible
2.4.5.Analyse des données cinétiques
2.5. Méthode microscopie confocale de fluorescence
2.5.1. Préparation du mowiol et du paraformaldéhyde 4 % pour la fixation des cellules
2.5.2.Ensemencement des cellules
2.5.3.Traitement par les inhibiteurs
2.5.4.Traitement par les substrats et co-substrats
2.5.5.Traitement par les sondes fluorescentes et fixation des cellules
2.5.6.Microscopie confocale de fluorescence
2.6. Mesure de la fluorescence du dihydroéthidium sur cellules
2.6.1. Préparation des solutions
2.6.2. Préparation et traitement des cellules
2.6.3.Mesure de fluorescence
2.7. Mesure de la production du 2-hydroxyéthidium dans les cellules par HPLC-MS
2.7.1. Préparation des solutions
2.7.2.Traitement des cellules
2.7.3.Méthode HPLC-MS
Bibliographie