Activité enzymatique 

Activité enzymatique 

Statut enzymatique antioxydante

 Afin d’évaluer le statut enzymatique antioxydant myocardique des rats de chaque population à la fin des différents séjours expérimentaux, des cœurs ont été prélevés, clampés à froid dans de l’azote liquide puis conservés à –80°C. Les tissus ventriculaires prélevés étaient homogénéisés dans un tampon Tris-HCl (Tris HCl 60mM), contenant 1 mM d’acide diéthylènetriaminepenta-acétique (pH 7.4, 10ml/g w.wt), à l’aide d’un homogénéisateur de téflon. Les tissus homogénéisés étaient ensuite centrifugés à 2000 g et 4°C pendant 10 min afin d’éliminer les débris cellulaires. L’homogénat ainsi obtenu était utilisé pour évaluer les activités enzymatiques de la SOD, de la CAT et de la GPx. Les activités enzymatiques sont exprimées en unité internationale par milligramme de protéine (UI/mg prot). Le dosage des protéines de l’homogénat était réalisé selon la méthode décrite par Lowry et al., (1951). 

Evaluation de l’activité enzymatique de la SOD

 Le dosage de l’activité de la SOD cardiaque a été réalisé selon la méthode décrite par Marklund (1976), fondée sur l’inhibition de l’auto-oxydation du pyrogallol avec l’O2 .- par la SOD. La réalisation d’une droite de référence de la variation de la densité optique par min (ΔDO/min) à partir de solutions gammes de SOD commerciale (de 0 à 25 mg/L) permettait d’évaluer la concentration de SOD des échantillons tissulaires. La ΔDO/min était déterminée par spectrophotométrie à 410 nm. Biochimie Matériel et méthode 

Evaluation de l’activité enzymatique de la CAT

Le dosage de l’activité de la CAT cardiaque a été réalisé selon la méthode décrite par Beers et Sizer (1952), fondée sur la décomposition de l’H2O2 par la CAT. L’activité de la CAT était déterminée par spectrophotométrie suivant la disparition de l’H2O2 à 240 nm.

 Evaluation de l’activité enzymatique de la GPx

 Le dosage de l’activité de la GPx cardiaque a été réalisé selon la méthode décrite par Flohe et Gunzler (1984), fondée sur la réduction des hydroperxydes organiques en alcools par la GPx parallèlement à l’oxydation du glutathion réduit (GSH) en glutathion oxydé (GSSG). Ce dernier, dont la formation est dépendante de l’activité de la GPx, est ensuite réduit par la glutathion réductase (GRx) en présence de NADPH. L’activité de la GPx était déterminée par spectrophotométrie suivant la décroissance de l’absorption du NADPH à 340 nm. 2GSH + ROOH GSSG + H2O + ROH GSSG +NADPH + H+ 2 GSH +NADP+ GPx GRx 

Evaluation de l’activité de la thioredoxine réductase

 La thiorédoxine est une enzyme à activité antioxydante intrinsèque qui est réduite par la thiorédoxine réductase (TrxR). L’évaluation de l’activité de la TrxR peut être utilisée comme marqueur du stress oxydant. En effet, en situation de stress oxydant, l’expression de la Matériel et méthode – 94 – thiorédoxine et de la TrxR est activée de façon à renforcer le statut antioxydant cellulaire global. Le dosage de l’activité de la TrxR a été réalisé selon la méthode dérivant de celle d’Ellman Riddles (Arner et al., 1999). Ce dosage est fondé sur la réduction du réactif d’Ellman (le DTNB) en TNB en présence de NADPH. L’activité de l’enzyme était déterminée en suivant l’augmentation de l’absorption du TNB à 405 nm. 

Activité de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les effluents coronaires au cours du protocole d’IR

La LDH, utilisée comme marqueur de mort cellulaire, a été dosée à partir du recueil des effluents coronaires réalisé au cours du protocole d’IR. L’évaluation de son activité était effectuée à l’aide d’un kit de dosage spécifique (LDH-P, BIOLABO SA, France). Le principe repose sur la réaction, médiée par la LDH, du pyruvate avec le NAD pour former du lactate et du NADH. L’activité de la LDH était déterminée par spectrophotométrie suivant la disparition du NAD à 340 nm.

Production de NO au cours du protocole d’IR 

La production de NO a été estimée à partir de l’évaluation de la concentration de dérivés nitrés (nitrites/nitrates) dans les effluents coronaires. La quantification des nitrites/nitrates dans ces effluents est en effet classiquement utilisée dans la littérature scientifique comme indice de la production de NO (Kobara et al., 2003 ; Bitar et al., 2005 ; Heinzel et al., 2008). Le dosage des nitrites totaux a été réalisé suivant la méthode de Griess après réduction des nitrates en nitrites (QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit (DINO-250)). La quantité de nitrite était déterminée par évaluation de l’absorbance à 540 nm. 

Peroxydation lipidique myocardiqu

La peroxydation lipidique myocardique a été estimée à partir de la concentration tissulaire en substances réagissantes avec l’acide thiobarbiturique (TBARS). Les tissus VG prélevés étaient homogénéisés dans 1 ml de solution d’acide trichloroacetic 0,1 % (TCA). L’homogénat était ensuite centrifugé à 12000 g pendant 15 min et 0.5 ml de surnageant était ajouté à 1 ml de solution à 0.5 % d’acide thiobarbiturique (TBA) et 20 % de TCA. La solution était incubée dans l’eau bouillante pendant 30 min, puis la réaction était stoppée en la plaçant dans un bain d’eau glacée. Les tubes étaient vortexés et 200 μl étaient placés dans une plaque 96 puits afin de lire l’absorbance du surnageant à 532 nm. La valeur d’absorption non spécifique à 600 nm était soustraite. La concentration de TBARS était ensuite calculée en utilisant un coefficient d’extinction de 155 mM-1 .cm -1 .