Agrégation plaquettaire induite par les bactéries

Préparation des plaquettes

Le plasma riche en plaquettes (PRP) a été préparé selon les recommandations de l’ISTH (175) à partir de prélèvements de sang veineux périphérique, prélevés sur tubes contenant 3.2% de citrate de sodium (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), de donneurs sains (n=80), n’ayant pas d’infection ni pris de traitement anti-inflammatoire ou anti-agrégant dans la semaine précédant le prélèvement. Une numération plaquettaire a été réalisée sur l’analyseur d’hématologie SYSMEX XN 3000 SP-10, à l’issue de l’étape de centrifugation (110g pendant 10 minutes à 20°C). La suspension plaquettaire a été ajustée à 250 G/L avec le plasma dépourvu en plaquette (PDP) du patient correspondant. Ce PDP a été obtenu par centrifugation à 2300 g pendant 10 minutes à 20°C.
Les PRP ainsi obtenus sont alors incubés dans un bain marie à 37°C afin de maintenir les plaquettes au repos jusqu’au moment de l’analyse. Pour chaque prélèvement, une mesure de l’état de l’activation plaquettaire a été réalisée par la mesure de l’expression de la P-sélectine par cytométrie de flux.
Les plaquettes lavées ont été préparées pour les essais de cytométrie en flux selon le protocole du laboratoire. Elles ont donc été obtenues à partir d’une seconde centrifugation du PRP à 1100g pendant 10 minutes à 20°C, à la suite de laquelle le surnageant a été jeté et le culot plaquettaire a été repris avec du PBS (CHEMSOLUTE Dutscher). La concentration finale de la suspension plaquettaire était de 250 G/L.

Préparation des souches bactériennes

Toutes les souches bactériennes utilisées sont issues de la collection de souches de l’IHU Méditerranée Infection et ont été qualifiées par Maldi-Tof selon le protocole classiquement utilisé (176). 5 souches de Staphylococcus aureus ont été testées, 4 isolées à partir d’hémocultures réalisées chez des patients ayant présenté des endocardites infectieuses avec de grosses végétations et des complications emboliques (souches : SA P6142, P6207, P6175, P6141), une souche était obtenue à partir de bactériémie non compliquée d’EI: SA P2188 (Annexe 1).

Traitement in vitro de PRP de sujets sains par des antiplaquettaires pour les tests d’agrégation

Les PRP issus de donneurs sains ont été séparés en plusieurs aliquots de 400µL et traités soit par:
– Aspirine (inhibiteur de la cyclooxygénase) pour une concentration finale de 2mM (146,178)
– Ticagrelor (inhibiteur de la voie de P2Y12) pour une concentration finale de 10µM (179)
– Tirofiban (Anti GpIIbIIIa) pour une concentration finale de 5µM (180).
Un aliquot n’a reçu aucun traitement. Une partie de cet aliquot non traité sera stimulé par du TRAP (Thrombin Receptor Activating Peptide) 20µM (AgroBio, STAGO) et sera alors considéré comme contrôle positif, ou par du NaCl 0.9% et sera alors considéré comme contrôle négatif.
Les échantillons ont été incubés pendant 30 minutes au bain marie à 37°C (146). Les PRP traités ou non ont été incubés avec les différentes souches bactériennes pour une concentration finale de 10^9 CFU/ml pour S. aureus et de 3*10^9 pour S. sanguinis, respectivement pendant 15 à 30 minutes et 10 minutes (181).

Agrégation plaquettaire induite par les espèces bactériennes

Les essais ont été réalisés sur un agrégomètre de type APACT 4004 (LABiTec). Le principe de l’agrégation repose sur le principe de la turbidimétrie avec agitation constante et maintien de la température à 37°C. L’analyse est faite sur le logiciel APACT LPC-Software.
La calibration de l’agrégomètre s’est faite en utilisant le PRP du patient correspondant à 0% de transmission lumineuse soit 0% d’agrégation et son PDP correspondant à 100% de transmission lumineuse soit 100% d’agrégation.
180µL de PRP ont été traités avec 20µL de suspension bactérienne pour S. aureus. Pour les essais avec S. sanguinis, 170µL de PRP ont été traités par 30µL de suspension de S. sanguinis (38). L’enregistrement via transmission lumineuse de l’agrégation plaquettaire a été réalisé pendant 20 minutes.

Analyse de l’activation plaquettaire par Cytométrie de flux après traitement par les suspensions bactériennes

Les plaquettes lavées et traitées ou non par antiplaquettaire, selon le même protocole que pour l’agrégation plaquettaire, sont mises en contact avec la suspension bactérienne (20 µL + 180µL de suspension plaquettaire) et sont incubées au bain marie pendant 1 heure à 37°C.
A l’issue d’une heure d’incubation, les plaquettes lavées (180µL) traitées ou non par antiplaquettaire ont été traitées pendant 30 minutes avec 4µL du CD41 PC5 de Beckman Coulter et du CD62P PE-Cy5 de BD biosciences (conditions de saturation testées au laboratoire, dilution 1/50e).
Le contrôle négatif, incubé en parallèle, correspond à des plaquettes lavées suspendues dans du NaCl. Le contrôle positif correspond à des plaquettes lavées traitées par du TRAP 20µM (AgroBio, STAGO) et a été réalisé pour chaque expérience.
Tous les patients ont été analysés en double passage.
Les analyses ont été réalisées sur un cytomètre de flux FC 500 (Beckman Coulter) et les résultats ont été analysés avec les logiciels CXP cytometer software (acquisition) et Kaluza flow cytometry analysis.
Les résultats sont exprimés en MFI (unités arbitraires).

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 5. En fonction de la normalité ou non de la distribution des valeurs, évaluée par le test de normalité de Shapiro-Wilk, les comparaisons entre les groupes ont été faites par des T-tests paramétriques ou par des tests de Wilcoxon (non paramétriques) sur des données appariées.
Une différence était considérée comme significative lorsque p<0.05.