Détection et analyse des produits de PCR

Principe de la PCR

Dans la cellule, la duplication a lieu juste avant la mitose. L’ADN polymérase intervenant, ne fait qu’allonger des chaînes de nucléotides à partir d’un double brin. Après la séparation des deux brins d’ADN (dénaturation), des fragments d’ARN appelés amorces s’apparient (ou s’hybrident) à l eurs séquences complémentaires au niveau de chaque brin d’ADN. Puis l’ADN polymérase les allonge par ajout de nucléotides aboutissant ainsi à la formation d’une copie complémentaire de chaque brin d’ADN. On a ainsi deux nouvelles molécules identiques à la molécule de départ (Darnel et al., 1988). Une polymérisation est ainsi faite.
La PCR est basée sur ce même principe. Elle consiste à u tiliser deux amorces oligonucléotidiques de synthèse de 20 à 25 nucléotides complémentaires des extrémités 5’ de deux brins d’ADN encadrant la séquence à amplifier. Sous l’action de l’ADN polymérase, chaque amorce est allongée dans le sens 5’→ 3’ d’une séquence exactement complémentaire du brin recopié. Une réaction de PCR correspond à une succession d’environ 30 cycles comportant chacun trois étapes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation.
La répétition des cycles aboutit à une amplification exponentielle de la séquence cible considérée (figure 2).

Composantes de la PCR

Pour faire une bonne PCR, les éléments nécessaires sont : L’ADN, les amorces, l’enzyme de polymérisation, le tampon, les nucléotides et l’eau.

L’ADN

Généralement sous forme de double brin contenant le fragment à amplifier, il constitue la cible à partir de laquelle se feront les copies. Les origines de cet ADN peuvent être multiples : tissus frais, tissus conservés l’état sec, tissus sec conservés à -70°C, tissus conservés dans de l’alcool, échantillon de sang … (Scott et al., 1993).
L’ADN ne doit pas comporter de rupture au niveau des séquences à amplifier. Il doit être pur c’est-à-dire être débarrassé des protéines qui lui sont associées. Ces impuretés peuvent conduire à des amplifications parasites dues aux ARN ou à une baisse du rendement par le fait des protéines associées comme les histones (Kaplan & Delpech, 1993 ; Delpech et al., 1999). Il peut être associé à des inhibiteurs de la Taq polymérase soit lors de son extraction, soit lors de sa conservation. Des lavages au chloroforme permettent d’éliminer le phénol. Des dilutions de solution d’ADN permettent de réduire l’effet de ces produits (Ju & Charron, 1992 ; Jackson et al., 1993 ; Paskewitz et al., 1993 ; Delpech et al., 1999).

Les amorces

Ou primers en anglais, ils sont au nombre de deux (amorce sens et amorce antisens) et sont de petits brins d’ADN d’environ 20 b ases chacun, capables de s’hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases sur le brin d’ADN ou sur son brin complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier. Elles doivent avoir des quantités (G et C, A et T) sensiblement égales afin d’éviter la formation de structure secondaires comme les boucles (Innis & Gelfand, 1990 ; Taylor, 1993). La séquence de l’une des amorces ne doit pas être complémentaire à l’autre pour éviter l’hybridation entre amorces (Bogard & Lamoril, 1998). Les fortes concentrations doivent être évitées car elles entraînent des amplifications de séquences non ciblées (Innis & Gelfand, 1990).

L’enzyme

La plus utilisée est la Taq polymérase, une ADN polymérase thermorésistant extraite de la bactérie Thermus aquaticus qui vit dans les sources thermales entre 80° C et 90°C (Kaplan & Delpech, 1993). Sa température optimale d’action varie entre 65°C et 72°C (Taylor, 1993) et elle est capable de résister à d es passages successifs à 95°C, ce qui a r endu possible l’automatisation à l a procédure. A cette température, la Taq polymérase est capable de juxtaposer 100 nucléotides par seconde. Les faibles et fortes températures ont pour effet de diminuer l’activité de la Taq polymérase.
Il faut savoir que les Taq polymérases d’origines différentes, se comportent différemment (Innis & Gelfand, 1990 ; Meunier & Grimont, 1993) et ceci doit être pris en compte si l’on veut utiliser la technique PCR. Certains auteurs préfèrent, si le nombre d’échantillons à traiter est petit, ajouter la Taq polymérase après le premier cycle de dénaturation pour avoir un rendement maximum (Kapland & Delpech, 1993).

Les nucléotides

Les solutions de travail sont constituées d’un mélange équimolaire des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) groupés sous le nom de dNTP (désoxy Nucléotides Triphosphates). Ce type de mélange permet d’éviter les erreurs d’incorporation par la Taq polymérase (Innis & Gelfand, 1990). Il e st préférable d’utiliser les faibles concentrations en nucléotides car elles ont pour effet de minimiser les mauvais appariements des amorces à des sites non ciblés.

Le tampon

Le tampon est optimisé en fonction des paramètres de la PCR. Sa composition est très variée et en général il se compose de Tris-HCL (Tris hydroxyméthyl amino méthane), de Chlorure de Magnésium (MgCl2), de Chlorure de Potassium (KCl), de détergents et de gélatine.

Le Tris HCl

Il régule le pH de la réaction qui intervient au niveau de l’activité de la Taq polymérase. Le pH du Tris HCl décroît de 0,03 unité par degré lorsque la température augmente, permettant ainsi d’obtenir à 72 °C la valeur d’activité optimale de la Taq polymérase (Innis & Gefand, 1990 ; Kocher & Wilson, 1993).

Le chlorure de Magnésium

Les Mg2+ fournis par le Chlorure de Magnésium sont nécessaires à l’activité à la fidélité de la Taq polymérase et affectent pratiquement tous les autres paramètres de la réaction : hybridation, dénaturation, spécificité, formation de dimères d’amorces. Ils peuvent interagir avec les nucléotides, mais aussi, chélatants comme l’EDTA. De ce fait, ils deviennent inaccessibles à l a Taq polymérase qui est alors inhibée, entraînant ainsi une baisse du rendement de la synthèse. Les protéines et les acides nucléiques peuvent également fixer le MgCl2 (Elie, 1993) le rendant inaccessible par la Taq polymérase, d’où l’intérêt d’éviter les très fortes concentrations en ADN cible.

Le Chlorure de potassium

Les sels ont un rôle très important car ils facilitent l’hybridation des amorces malgré leur action inhibitrice sur la Taq polymérase, d’où l’intérêt d’optimiser sa concentration dans le milieu (Innis & Gelfand, 1990 ; Kocher & Wilson, 1993 ; Kaplan & Delpech, 1993).

Les détergents et la gélatine

les détergents tels que le Triton x 100, le NP40 ou le Tween 20 sont parfois ajoutés dans le milieu pour stabiliser la Taq polymérase et lui confèrent le maximum d’activité car celle-ci, fortement hydrophobe, a tendance à précipiter en solution aqueuse (Innis & Gelfand, 1990 ; Kocher & Wilson, 1993).
La gélatine a l’avantage quant à elle de supporter les températures de dénaturation.

L’eau

L’eau a un rôle très important car elle permet de diluer le tampon en réduisant sa concentration ionique.

Conditions de la réaction

Une réaction de PCR correspond à la succession d’une trentaine de cycles comportant chacun trois étapes : dénaturation, hybridation et élongation. Tous les éléments nécessaires à l a réaction sont regroupés dans une solution appelée « mix » qui sera soumis aux différentes températures correspondant à ch aque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thermocycleur.

Dénaturation

Le tube contenant le « mix » est chauffé entre 30s et 1mn à 94 °C ou pendant 15s à 97 °C (Innis & Gelfand, 1990 ; Paskewitz & Collins, 1990 ; Taylor, 1993) pour séparer les deux brins de l’ADN : l’ADN est dit dénaturé. Les mauvaises amplifications peuvent résulter d’une dénaturation incomplète. Pour cette raison, une première phase de dénaturation plus longue de 5 mn est incluse. Elle ne se répète pas tout au long de l’amplification. Elle permet de s’assurer que tout l’ADN cible se trouve sous la forme simple brin. Avec des temps de dénaturation très long, on assiste à une baisse du rendement puisque l’effet du plateau est très vite atteint. L’effet de plateau se traduit par une inactivation d’une grande partie de la Taq polymérase, une raréfaction des nucléotides et des amorces.

Hybridation

Elle a lieu lors du refroidissement, la température est rapidement abaissée à 55 °C. Les amorces reconnaissent leur séquence complémentaire sur les brins d’ADN cibles. Elles s’hybrident chacune sur son brin respectif. Cette réaction dure 1 mn pour laisser le temps aux amorces de s’hybrider correctement.
Le refroidissement doit se faire très rapidement afin d’éviter la possible renaturation de l’ADN cible c’est-à-dire la ré-assocation des deux brins, et de permettre aux amorces qui sont en très fortes concentrations de s’hybrider à leur séquence complémentaire sur l’ADN cible.

Elongation

Elle se fait par une élévation de la température et elle est optimale à 72 °C. Lorsque les séquences à amplifier sont très longues, il est nécessaire d’allonger le temps d’extension de 1 à 3 mn. Une phase d’extension plus longue (5 à 10 mn) a lieu après le dernier cycle. Elle permet d’obtenir une meilleure amplification après une raréfaction de substrats (nucléotides et amorces) et une saturation de la Taq polymérase qui a été inactivée pour une grande partie par la chaleur (effet plateau).

Détection et analyse des produits de PCR

Migration électrophorétique

Les fragments d’ADN après amplification par Nested PCR, sont séparés par électrophorèse. Celle-ci est la migration de particules chargées sous l’influence d’un champ électrique. En PCR, les fragments obtenus sont analysés sur gels d’agarose ou d’acrylamide. Lors de la polymérisation, ces g els définissent des mailles plus ou moins régulières entre lesquelles passent les molécules à des vitesses différentes selon leur taille. Plus le fragment a une taille élevée, moins la migration électrophorétique par rapport aux puits d’inclusion sera importante. A l’opposé, les fragments de petite taille auront une distance de migration plus grande. La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse, est effectuée en faisant migrer un marqueur de taille (ou poids moléculaire) en parallèle avec les échantillons à analyser.

Révélation des produits de PCR

Les produits de PCR sont visualisés après marquage ; les méthodes de marquage les plus sensibles sont celles qui utilisent soit du bromure d’éthidium, soit du nitrate d’argent, soit des radioisotopes.
– Marquage au bromure d’éthidium : c’est une molécule qui s’intercale entre les bases de la molécule d’ADN double brin. Il donne une fluorescence orange en présence de rayons ultraviolets, cette fluorescence est plus prononcée dans les zones où sont concentrées les molécules d’ADN.
– Marquage au nitrate d’argent : La coloration au nitrate d’argent, plus sensible que celle au bromure, permet de conserver le gel coloré.
Marquage aux radioisotopes : Les nucléotides ou les amorces utilisées dans le « mix » sont marquées avec des radioisotopes (soufre 35 e t phosphore 32) ; La révélation se fera par autoradiographie.