Principe de la détection

 Principe de la détection

Au debut des annees 1950, Coulter a mis au point un systeme permet tant de compter des particules dispersees en solution [12]. Le principe du compteur Coulter est la base des techniques actuelles de detection electrique du passage de particules a travers un pore a lechelle unique. Ce principe, illustre sur la gure 1.1, est le suivant : une paroi percee dun pore separe deux compartiments remplis dune solution contenant des ions et les parti cules a compter.

Lapplication dune force (de pression ou electrique) pro voque un ecoulement a travers le pore. Le ux dions a travers le pore genere un courant electrique, mesure par deux electrodes placees de part et dautre du pore. Lorsque le pore est totalement libre au passage des ions, le courant mesure est maximal. Le passage dune particule dans le pore bloque par tiellement le passage des ions, provoquant une chute temporaire du courant 

Coulter et trace de courant associee. (1) : la particule est hors du pore, le courant mesure est maximal. (2) : la particule est dans le pore, le courant est partiellement bloque. (3) : la particule est ressortie du pore, le courant a retrouve son niveau maximal. mesure. Le courant retrouve sa valeur maximale lorsque la particule ressort du pore. Le nombre de chutes de courant correspond donc au nombre de particules ayant sejourne dans le pore.

En outre la profondeur du bouchage est liee a la taille de la particule, la frequence des bouchages a la concen tration des particules en solution et la duree du bouchage a la vitesse de la particule dans le pore. Il faut noter quune baisse du courant ne correspond pas forcement a une traversee du pore : une particule peut entrer dans le pore et ressortir du meme cote.

La presence dune particule dans le pore nest detectable que si le bou chage du courant est signi catif par rapport aux uctuations de courant 12 dans le pore libre. Le diametre du pore doit donc etre de lordre de la taille de la particule a detecter. Le compteur Coulter a ete utilise pour compter et mesurer des particules de taille micrometrique, comme les cellules san guines [33, 34]. Dans les annees 1970,

Deblois et Bean ont a ne la detection en utilisant des pores dune centaine de nanometres de diametre perces dans des membranes de polycarbonate par la methode du track-etching [35, 36]. Apres le percage, tous les pores obtenus ont ete bouches sauf un. Ce dis positif a permis de detecter des collodes [35] et des particules virales [36], pour des tailles aussi petites que 60 nm.

A lechelle moleculaire (de lordre du nanometre) les premiers pores uti lises ont ete des pores biologiques. Des les annees 1960 de nombreux indices suggeraient lexistence de proteines formant des canaux pour le passage des ions a travers les membranes lipidiques des cellules [1]. Grace aux techniques de reconstitution de membranes (bicouches) planes de lipides [37, 38], il a ete possible de mesurer in vitro le courant circulant a travers un canal mem branaire.

Hladky et Haydon ont ete les premiers a realiser une telle mesure en 1970, en observant le courant circulant a travers des pores de gramici dine A inseres dans une membrane de lipides reconstituee [9]. La technique du patch-clamp initiee par Neher et Sakmann en 1976 [10] a ensuite permis de mesurer le courant a travers des canaux sur des membranes biologiques intactes.

Le blocage temporaire du courant a travers un canal membranaire a ete observe pour la premiere fois par Neher et Steinbach en 1977 [39]. Lors de louverture dun canal recepteur de lacetylcholine, un courant de quelques picoamperes est temporairement bloque en presence dun anesthesique, sur 13 Electrodes I Salt Bridges Figure 1.2 Schemadun montage typique de detection a lechelle moleculaire, adapte de Bezrukov et al [40].

Vue de la cellule de mesure (en haut) : deux compartiments conte nant la solution a analyser sont separes par une paroi. Deux electrodes appliquent une tension electrique entre les deux compartiments et mesurent le courant resultant. La paroi est percee dun trou dans lequel une bicouche de lipides est reconstituee (en bas a gauche).

Un pore unique de taille nanometrique est insere dans la bicouche de lipides, dans lequel les molecules en solution peuvent circuler (en bas a droite). des durees de lordre de la milliseconde. Par la suite des polymeres ont ete utilises pour sonder les dimensions internes de di erents pores proteiques [14, 15, 16, 17]. Lidee est dessayer de faire entrer dans le pore des polymeres de taille connue de plus en plus gros, jusqua ne plus y parvenir.