Préparation des échantillons de stratum corneum non digéré

Echantillons de peau

Les échantillons de stratum corneum plantaire correspondent à de la corne de pieds obtenue par prélèvement par des pédicures sur des sujets sains.
Les extraits de stratum corneum non plantaire ont été obtenus sur des sujets volontaires sains suivant le protocole publié dans la littérature [192]. Brièvement, le mollet est recouvert d’une bande de nylon (60cm²) puis de vernis. Après dix minutes de séchage, la bande est arrachée. Le vernis est dissous avec 60mL d’acétone ce qui libère les cornéocytes. Ceux-ci sont lavés par 180mL d’acétone. Enfin la poudre acétonique est récupérée après filtration et séchage.

Extraction des peptides

Différents solvants ont été utilisés sans adjonction de composés dénaturants :
• Tampon phosphate (PBS) 10mM
• Tampon (EDTA) 5mM
• Tampon (Tris) 0,5M pH=6,8
• Tampon (Tris) 0,5M pH=8,2
• Solution aqueuse de chlorure de sodium (NaCl) 2M
• Solution aqueuse d’acide trifluoroacétique (TFA) 0,1% (v/v)
• Méthanol (MeOH) en présence de TFA (MeOH/H2O/TFA 80/20/0,1, v/v/v)
• Solution aqueuse d’acide formique (AF) 1%
• Méthanol en présence d’AF (MeOH/H2O/AF 80/20/1, v/v/v) 5 mg de peau (SCP ou PA) sont extraits dans 500µL de solvant/tampon durant une nuit à 4°C, sous agitation douce (800tpm). Après agitation, l’échantillon est soniqué dix minutes dans un bain à ultrasons.

Etape d’ultrafiltration

L’échantillon est fractionné par gamme de masse sur des micro-colonnes d’ultrafiltration Vivaspin
500 (Vivascience) selon le protocole suivant :
Equilibre de la micro colonne : Déposer 600µL de PBS 10mM sur les colonnes (seuil 5kDa et seuil 10kDa) et centrifuger 10 minutes à 13 000 tpm à température ambiante.
Jeter le PBS présent dans le tube et le volume restant dans la colonne.
Dépôt de l’échantillon : Déposer le volume d’échantillon sur la micro colonne de seuil 10kDa.
Centrifuger environ 10 minutes à 13 000 tpm à température ambiante.
Conserver à 4°C le volume restant au-dessus de la colonne (fraction sup 10kDa). Déposer l’éluat sur la micro colonne de seuil 5kDa.
Centrifuger la colonne environ 10 minutes à 13 000 tpm à température ambiante.
Conserver à 4°C le volume restant sur la colonne (fraction 5-10kDa) Conserver l’éluat. (fraction inf 5kDa) à 4°C.
A la fin de cette étape, trois types d’échantillons sont récupérés :
• une fraction de protéines et de peptides de masse supérieure à 10kDa (environ 50µL).
• une fraction de peptides de masse comprise entre 5 et 10kDa (environ 50µL).
• une fraction de peptides de masse inférieure à 5kDa (environ 400µL).

Etape de reconcentration des peptides

Afin d’éliminer les sels et reconcentrer les échantillons, les différentes fractions de peptides subissent une étape de reconcentration sur des micro-colonnes de silice greffée octadécyl (ZipTipTM C18, Millipore, St Quentin en Yvelines, France). Cette étape est réalisée grâce au robot Genesis Proteam (Tecan) (Figure 74).

Séparation des peptides par LC1D

Echantillons non digérés

RPLC- nanoESI-QqTOF

Les analyses ont été réalisées sur un système chromatographique Famos-Switchos-UltiMate (LC Packings, Pays-Bas) couplé au nanoESI-QqTOF (Micromass, Royaume-Uni). Les peptides sont chargés sur une précolonne (C18 PepMap100, 5µm, 100Å, 300µm d.i., 5mm de longueur, Dionex, Pays Bas), dessalés et concentrés par du solvant A (H2O/ACN/AF, 98/2/0,1, v/v/v) au débit de 15µL/min pendant 15 min. Ils sont alors élués vers la colonne analytique à polarité de phases inversée (C18 PepMap100, 3µm, 100Å, 75µm d.i., 15cm de longueur, Dionex) avec un débit de 220nL/min. Le gradient utilisé est un gradient linéaire de 0 à 50% de solvant B (ACN/H2O/AF, 90/10/0,1, v/v/v) en 35min, puis un palier isocratique de 15min à 100% B et enfin 15min de rééquilibrage de la colonne en solvant A.

RPLC- nanoESI-FTMS

Les analyses ont été réalisées sur un système chromatographique Agilent 1200 (Agilent Technologie, Etats-Unis) couplé au nanoESI-LIT-FTICR ou au nanoESI-LIT-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, 149 Etats-Unis). Les peptides sont chargés sur une précolonne (C18 Zorbax300SB, 5µm, 300Å, 300µm d.i., 5mm de longueur, Agilent), dessalés et concentrés par du solvant A (H2O/ACN/AF, 98/2/0,1, v/v/v) au débit de 15µL/min pendant 5 min. Ils sont alors élués vers la colonne analytique à polarité de phases inversée (C18 Zorbax 300SB, 3µm, 300Å, 75µm d.i., 15cm de longueur, Agilent) avec un débit de 300nL/min. Le gradient utilisé est un gradient bilinéaire de 0 à 13% de solvant B (ACN/H2O/AF, 90/10/0,1, v/v/v) en 3 min puis de 13 à 44% de B en 42 min, un palier isocratique de 15min à 100% B et enfin 15min de rééquilibrage de la colonne en solvant A.

Echantillons digérés

RPLC-nanoESI-FTMS

Les analyses ont été réalisées sur un système chromatographique Ultimate 3000 (Dionex, Pays Bas) couplé au nanoESI-LIT-FTICR ou au nanoESI-LIT-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Etats-Unis). Les peptides sont chargés sur une précolonne (C18 PepMap100, 5µm, 100Å, 300µm d.i., 5mm de longueur, Dionex, Pays-Bas), dessalés et concentrés par du solvant A (H2O/ACN/AF, 98/2/0,1, v/v/v) au débit de 15µL/min pendant 15 min. Ils sont alors élués vers la colonne analytique à polarité de phases inversée (C18 PepMap100, 3µm, 100Å, 75µm d.i., 15cm de longueur, Dionex) avec un débit de 220nL/min. Le gradient utilisé est un gradient linéaire de 0 à 50% de solvant B (ACN/H2O/AF, 90/10/0.1, v/v/v) en 35min, puis un palier isocratique de 15min à 100% B et enfin 15min de rééquilibrage de la colonne en solvant A.

RPLC-MALDI-TOF/TOF

Les analyses ont été réalisées sur un système chromatographique Ultimate 3000 (Dionex, Pays-Bas) couplé au MALDI-TOF/TOF 4800 (Applera Applied Biosystems, Framingham, MA). Les peptides sont chargés sur une précolonne (C18 PepMap100, 5µm, 100Å, 300µm d.i., 5mm de longueur, Dionex, Pays-Bas), dessalés et concentrés par du solvant A (H2O/ACN/AF, 98/2/0,1, v/v/v) au débit de 20µL/min pendant 15 min. Ils sont alors élués vers la colonne analytique à polarité de phases inversée (C18 PepMap100, 3µm, 100Å, 75µm d.i., 15cm de longueur, Dionex) avec un débit de 220nL/min. Legradient utilisé est un gradient linéaire de 0 à 50% de solvant B (ACN/H2O/AF, 90/10/0.1, v/v/v) en 35min, puis un palier isocratique de 15min à 100% B et enfin 15min de rééquilibrage de la colonne en solvant A. L’éluat est déposé sur une plaque MALDI vierge en utilisant le robot de dépôt Probot (Dionex) à partir de t=15min (par rapport au début du gradient) pendant 40min. Pour chaque run, 240 spots (1 toutes les 10s) sont collectés avec l’ajout coaxial de matrice au débit de 442nL/min (CHCA 5mg/mL, 6:4:0,01 ACN/H2O/TFA v/v/v, 10mM citrate d’ammonium). Dans le cas du dépôt d’un run LC2D complet, l’ensemble des fractions SCX x RP (soit 15*240=3600 spots) sont déposés sur la même plaque.

Analyse des peptides par spectrométrie de masse

Analyse par spectrométrie de masse nanoESI-QqTOF

Les peptides élués sont détectés en ligne sur un spectromètre de masse hybride de type QqTOF (QTof2, Micromass Waters) équipé d’une source nanospray avec un capillaire d’ionisation en verre (New Objective, Etats-Unis). L’instrument est utilisé en mode positif sur la gamme de masse 400-1 300Th en mode MS et 50-2 600Th en mode MS/MS. Les données sont acquises automatiquement avec alternance du mode MS et du mode MS/MS (Figure 77). A chaque cycle complet, les 3 peptides les plus intenses (deux fois ou trois fois chargés) sont sélectionnés pour être fragmentés dans la cellule de collision.

Analyse par spectrométrie de masse nanoESI-LIT-FTICR

Les peptides élués sont détectés en ligne sur un spectromètre de masse hybride de type LIT-FTMS (LTQ-FT, Thermo Fischer) équipé d’une source nanospray avec un capillaire d’ionisation en verre (New Objective). L’instrument est utilisé en mode positif sur la gamme de masse 400-2 000Th (échantillons digérés) ou 500-2 000Th (échantillons non digérés) en mode MS. Les données sont acquises automatiquement en mode high dynamic avec alternance d’un full scan en mode MS dans la cellule ICR (résolution 25 000), de trois SIM scan dans la cellule ICR (+/- 5Th autour du précurseur, résolution 50 000) en parallèle des trois MS/MS réalisées dans le LTQ (Figure 78). A chaque cycle complet, les 3 peptides les plus intenses (au moins deux fois chargés) sont sélectionnés (fenêtre de sélection 4Th) pour être fragmentés dans la trappe avec une énergie de 35%.