Récolte et conservation du matériel biologique

Description de l’appareil

FONCTIONNEMENT : l’extraction au soxhlet est un proc édé mixte dans lequel l’échantillon à extraire est macéré dans le compartiment A, dans B la solution est chauffée à ébullition.
Sous l’effet de l’ébullition, les vapeurs de solvants montent dans le tube à vapeur et arrivent au réfrigérant où e lles se condensent pour t omber dans les récipients A et C. Une fois A et C remplis, le trop plein, par effet de capillarité, provoque un siphonage qui vide A dans le ballon et le cycle recommence.
PRINCIPE : C’est une extraction solide-liquide.
C’est le cas en général de l’extraction d’un organe biologique (végétal ou animal) par un s olvant. L’échantillon est mis sous forme de poudre afin d’augmenter la surface de contact.
PS : Ce procédé permet une économie de solvant. Par contre, il ne convient pas aux composés thermolabiles [39].

Séparation et purification

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

C’est le chimiste allemand Egon Stahl qui, le premier en 1956, a utilisé le terme Chromatographie sur Couche Mince (CCM). Elle utilise la propriété adsorbante des molécules. Sur une plaque – support de 20 × 20cm de verre, on étale des couches de faibles épaisseurs (1mm) d’adsorbant (silice) appelés phase stationnaire. Sur cette plaque, le mélange est déposé à l’aide d’une micro-pipette à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque [6].
L’éluant est versé dans la cuve de développement à une hauteur de 0,5 cm.
Quand le solvant du mélange déposé sur la plaque s’est évaporé, on place cette plaque dans la cuve de développement. L’éluant monte dans la phase fixe de la plaque entraînant les substances constituantes du mélange à des vitesses différentes à cause de leur solubilité ou coefficient de partage différent. Il se forme des zones séparées et distinctes correspondant à chacun des constituants du mélange. Cette séparation en fonction de la nature de la phase fixe est provoquée par le phénomène d’absorption de partage ou d’échange d’ions.
Quand le front de l’éluant arrive à 1 cm du bord supérieur, on retire la plaque et on la sèche. Puis on révèle les substances séparées. Les substances colorées se reconnaissent immédiatement ; certaines sont fluorescentes à la lumière UV.
Si l’échantillon est un mélange, chaque constituant possèdent un c oefficient d’absorption propre et une a ffinité déterminée pour que le solvant progresse avec une vitesse qui lui est caractéristique et qui est symbolisée par son Rf (référence au front) défini par la formule suivante [5],[7],[8].
Distance par parcourue le defront l’éluant
Distance par parcourue la substance Rf =

La phase stationnaire

Elle est constituée par un mélange d’eau distillée et de silice, qui donne une pâte épaisse et coulante qu’on étale uniformément sur la plaque à l’aide d’un étaleur.
Le format de la plaque utilisée est de 20 × 20. Après séchage à l’air libre on active la plaque dans le four 120-130°c pendant 45 mm [3].

La phase mobile ou l’éluant

Elle peut être constituée par un solvant ou par un mélange de solvants. Comme la vitesse de migration d’une substance sur un adsorbant donné dépend du solvant employé, on a établi des séries éluotropes de force d’ élution croissante.
Suivant des mélanges de deux, voire de trois solvants de polarité différente (système d’éluant) donnent de meilleures séparations que des éluants individuels.
Les éluants doivent être parfaitement purs (pour une bonne qualité de la chromatographie)
NB : Quand les substances en solution dans un solvant organique possèdent une affinité réduite pour les adsorbants hydrophiles courants, on choisit un adsorbant « fort » et des solvants « faibles ».Quand l’affinité d’absorption des substances est élevée on utilise à l’inverse des adsorbants « faibles » et des éluants « forts ».
PS : La CCM est la technique de choix quand on veut analyser de faibles quantités d’une substance en un minimum de temps et avec un minimum d’équipement.
Elle est extrêmement simple, facilement adaptable et peu coûteuse.
Elle ne nécessite que de très faibles quantités de produits à analyser.
Elle est la technique chromatographique la plus simple et la plus économique pour la séparation rapide des produits et leur évaluation visuelle [3],[5].

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (CLHP)

PRINCIPE : C’est une chromatographie de partage ou d’adsorption caractérisée par la finesse des particules de la phase solide (entre 5 et 30 µm), ceci nécessite de très fortes pressions (200 bars) afin d’obtenir un é coulement de la phase mobile.
La phase mobile est constituée par un mélange de solvants, de polarité et de force ionique variables, qui circule grâce à un système de pompage.
La phase stationnaire est constituée de billes de faible diamètre (généralement moins de 10 µm)
C’est une méthode qui s’adresse aux composés apolaires comme aux composés très polaires, et surtout aux substances thermosensibles. .
MECANISME : La colonne, qui contient la phase stationnaire est traversée par le mélange de solvants.
Le faible diamètre des particules qui constituent la phase stationnaire entraîne des pressions en tête de colonne très importantes.
Pour obtenir des débits adéquats de séparation il faut un système de pompage apte au traitement de telles contraintes
L’échantillon est injecté sous des pressions de plusieurs centaines de bars
En fonction de leurs propriétés physico-chimiques et de la nature de la phase mobile, les analyses vont être plus ou moins longtemps retenues sur la colonne et seront séparées en sortie de colonne.
Elles seront détectées puis le signal sera enregistré.

AVANTAGES

La CLHP permet l’analyse de composés thermosensibles, de composés apolaires comme très polaires, de molécules de masses moléculaires élevées.
Il est aussi possible de modifier la phase mobile au cours de l’élution.

INCONVENIENTS

Nécessité d’une étape de puri fication à partir de l’échantillon biologique : extraction liquide/liquide ou en phase solide. Mais aussi le prix très élevé du matériel ainsi que l’exigence d’injecter seulement des solutions pures dans la colonne afin d’éviter des blocages et une détérioration de la colonne.

PRECIPITATION

Cette méthode consiste à aj outer dans la solution un s olvant dans lequel les substances recherchées sont supposées insolubles. Cette technique fait appel à la technique de séparation liquide-liquide. Elle met à profit la solubilité différentielle des substances dans plusieurs solvants de polarité différente [39].

Analyses chimiques

Ce sont des tests de coloration.
Ils se fondent sur la réactivité de certaines fonctions comme les hydrates de carbones.
Test au chlorure ferrique d’éthanol (FeCl3/EtOH)
La solution de FeCl3 à 2% est obtenue par dissolution de 1g de FeCl3 solide dans 49g d’éthanol.
L’échantillon est ensuite dilué dans de l’EtOH dans un tube à essai dans lequel on ajoute 1 à 2 gouttes du réactif préparé. Si le mélange vire au vert, c’est que nous sommes en présence de fl avonoïdes avec un hydroxyle phénolique libre [10],[37].

TEST AU Mg/HCl

Là aussi l’échantillon dilué avec de l’EtOH dans un tube à e ssai, on a joute quelques grains de magnésium et quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré.
La coloration obtenue sera fonction du type de flavonoïdes présents[10],[11]. EXEMPLE : Rose pour les flavones et les flavonols ; jaune pour les isoflavones et généralement incolore pour les flavanones.

Test de Molisch

A 2 ml de la solution inconnue, on ajoute 2 gouttes d’une solution fraîchement préparée de α-naphtol à 10%. On mélange le tout puis, sans agiter, on ajoute 2 ml d’acide sulfurique concentré de telle sorte qu’il se forme une couche sous le mélange.
L’apparition d’un anneau rouge violacé à l’interface révèle la présence d’hydrate de carbone.
NB : Pour la préparation du réactif de Molisch, dissoudre 5g de α-naphtol dans100ml d’éthanol 95% [10] [17].

Analyses spectrales

La Spectrophotométrie UV visible

La Spectrophotométrie UV visible est la technique la plus sure pour l’analyse structurale des flavonoïdes.
Cette méthode est utilisée pour aider à l’identification des flavonoïdes et à la définition du type d’oxygénation.
En plus la position du groupe hydroxyle non substitué sur le noyau phénolique peut être établie par addition de réactifs à l’échantillon et observée sous forme de déplacements dans les pics d’absorption.
Donc indirectement la technique peut être utile dans la localisation du sucre ou du groupe méthyle attaché au phénol hydroxyle.
AVANTAGES : Le plus grand avantage de cette méthode est la très petite quantité de substances requise.

LA SPECTROPHOTOMETRIE IR

La spectrophotométrie infra rouge permet de déterminer la présence de groupements fonctionnels dans les molécules organiques. C’est une méthode très courante mais un peu laissée de coté ces dernières années au profit de la
Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), qui permet de déterminer avec une grande précision les structures moléculaires [4].
PRINCIPE : Dans les molécules, les liaisons vibrent à u ne fréquence bien déterminée qui dépend des atomes de la liaison mais aussi de l’environnement de la liaison. Pour un e fréquence donnée, ces liaisons rentrent en résonance.
L’énergie apportée est alors consommée, les molécules absorbent et la transmission diminue. Si on re présente sur un graphe l’évolution de la transmission en fonction de la fréquence ou, plus généralement (pour des questions pratiques), du nombre d’onde (la fréquence divisée par la vitesse de la lumière dans le milieu), on observe des variations.
Chaque pic (chaque absorption) est donc caractéristique d’un certain type de liaison.
Il existe différents types de vibrations :
• les vibrations d’élongation ν, généralement intenses
• les vibrations de déformation σ, où l’on distingue les déformations dans le plan, et hors plan [19],[25]