Haemophilus influenzae

APPELS SUR LES SOUCHES BACTERIENNES

Haemophilus influenzae 

Historique

Au cours de la pandémie de grippe de 1889-1892, Pfeiffer a observé et cultivé à partir de crachats de grippés un petit bacille, Bacillus influenzae et en fait l’agent étiologique de la « grippe» ou « influenzae » ; il a montré le rôle indispensable de sang pour la culture de cette bactérie et invente la gélose au sang.
Quelques années plus tôt, en 1883 en Egypte par Koch, en 1886 aux USA par Weeks, avait été observée, puis cultivée dans l’exsudat de conjonctivites purulentes une bactérie, bacille de Koch-Weeks, signalée dans un t raité de 1889 sous le nom de Bacillus aegyptius.
Le nom du genre Haemophilus (Haemophilus = qui aime le sang) a été proposé en 1917. En 1939, A. Lwoff propose le démembrement des « Haemophilae » et la création du genre Moraxella, suivi en 1952 par Moreno-Lopez qui propose le genre Bordetella. Jusqu’en 1933, date de la découverte de l’agent étiologique de la grippe, H. influenzae était resté, parfois avec des doutes, la bactérie suspectée d’être responsable de l’influenzae. En 1930 Miss M. Pittman met en évidence l’existence de souches capsulées, propose des types sérologiques et montre la prédominance du type b dans les méningites et autres infections aiguёs suppurées.

Systématique

La systématique est l’étude de la diversité du monde vivant ou biodiversité.
La classification des bactéries a toujours été et est encore de nos jours une préoccupation très importante pour les bactériologistes systématiciens. Celle-ci est extrêmement difficile et ne peut être établie que par la recherche objective et purement expérimentale des affinités des espèces en vue de grouper celles qui présentent des caractères morphologiques, cytologiques, physiologiques et immunochimiques semblables.
Les classifications actuelles des bactéries sont relativement nombreuses et nous ne citerons que les principales :
1. Classification française de A.R Prévot (1961).
2. Classification américaine du Bergy’s Manual (1957).
3. Classification anglaise de Topley et Wilson (1964).
4. Classification soviétique de Krassilnikov (1961). (27)
Pour ces deux souches, nous nous limiterons à la classification française de Prévot et celle du Bergy’s Manual. Dans « le Bergy’s Manual », le genre Haemophilus est placé dans la famille des Pasteurellaceae avec le genre Pasteurella et Actinobacillus.

Habitat 

Les Haemophilus font partie de la flore des muqueuses des voies respiratoires supérieures et de la cavité buccale de l’homme et de nombreux mammifères et oiseaux.
On n’en trouve pas dans la nature. Chez l’homme quatre écosystèmes les accueillent : le pharynx, la bouche, la planque dentaire et, à un degré moindre l’intestin et l’appareil urogénital.
Cependant H. influenzae est présent en moins grande quantité et est plus fréquent chez l’enfant. Le portage d’H. influenzae concerne 75 % des jeunes enfants et 35 % des adultes et des enfants âgés.
Il est par ailleurs plus rarement rencontré au niveau de la muqueuse buccale, de la salive et à l a surface de la muqueuse vaginale. H. influenzae de type b est l’une des trois principales espèces bactériennes responsables des méningites primitives chez les enfants âgés de 2 mois à 3 ans avec une incidence maximale entre 6 mois et un an. Les souchessont le plus souvent de biotype I.

Caractères bactériologiques 

Caractères morphologiques

Haemophilus influenzae se présente sous forme de petits bacilles ou coccobacilles de 0,3µ à 0,4 µ de diamètre sur 1 à 1,5 µ, non sporulés, immobiles, aéro-anaérobie facultatif, généralement capsulés et Gram négatif avec parfois une coloration bipolaire.
Le polymorphisme est très accentué dans certains produits pathologiques (crachats,
LCR) ou en culture.
La capsule tend à disparaître au cours des repiquages successifs

Caractères culturaux

Haemophilus influenzae ne peut pousser que sur des milieux de culture enrichis en sang, lequel lui apporte ses deux facteurs de croissance
 Le facteur X, thermostable, est constitué par l’hémine (ou hématine) qui est un composé tétrapyrrolique contenant du f er, dérivé de l’hémoglobine et des enzymes de la chaîne respiratoire (cytochrome, catalase, peroxydase). Enprésence du fer, l’hémine peut être remplacé par la protoporphyrine.
 Le facteur V, thermolabile, est constitué par :
– Soit du N AD (nicotinamide adénine dinucléotide) ou DNP (diphosphonucléotide) ou coenzyme I,
– Soit du NADP (NAD-phosphate) ou TNP (triphosphonucléotide) ou coenzyme II
Ce sont des coenzymes des déshydrogénases qui sont présentes dans les globules rouges, dans les tissus animaux et végétaux et chez la plupart des bactéries.
Cette double exigence permet de le distinguer des autres espèces en l’occurrence H. parainfluenzae qui ne nécessite que du NAD.
Cependant, puisque le sang frais contient également des inhibiteurs du facteur V, il est nécessaire d’utiliser des milieux d’isolement au sang cuit (15 mn à 75-80° C).Un chauffage excessif (100° C) détruit le NAD. Il est donc important de s’assurer de la qualité des milieux de culture.
En aérobiose, la croissance d’H. influenzae n’est pas dépendante de l’hémine, ce qui peut être source de difficultés d’identification.
L’exigence en NAD peut être recherchée sur des milieux additionnés de NAD purifié ou par la mise en évidence d’un satellitisme d’H. influenzae autour des colonies de Staphylococcus aureus qui produit du NAD.
Après 24 heures de culture à 3 7° C sur gélose-chocolat, H. influenzae donne des colonies lisses, convexes, grisâtres, translucides, de 0,5 à 1mm. Les souches encapsulées donnent des colonies mucoïdes de plus grosse taille. Certaines espèces nécessitent une atmosphère enrichie en CO2.

Caractères biochimiques

Huit biotypes (I à VIII) ont été définies pour H.influenzae à partir des caractères métaboliquessuivants : production d’indole, activités enzymatiques telles que l’uréase et l’ornithinedécarboxylase. Le biotype I est plus fréquemment retrouvé dans les méningites et le biotype IV dans les infections génitales.

influenzae possède une catalase et une peroxydase

Un certain nombre de caractères biochimiques et enzymatiques permet dans certains cas de le différencier des autres espèces voisines. (Voir l’annexe 1) (1,17)

Caractères antigéniques

La capsule

Les souches capsulées possèdent un antigène polysaccharidique lié à la capsule dont il existe six variants déterminant six sérovars : a, b, c, d, e, f.La spécificité de type dépend de la composition en polysaccharides de la capsule. Différents sucres ont été individualisés : glucose, ribose, galactose, acide mannuronique.
L’association fréquente entre sérotype b et biotype I semble être une conséquence de la diversité génétique limitée des H. influenzae de type b. (11)

La membrane externe 

Comme tous les bacilles à G ram négatif, H. influenzae possède une membrane externe constituée de protéines, de porines, de phospholipides et de lipooligosaccharides (LOS). Les LOS sont constitués de lipide A, de 2 céto-3 désoxyoctonate et d’oligosaccharides. Les profils électrophorétiques des LOSpermettent de définir des sous-types utilisables dans les études épidémiologiques.
Les protéines des membranes externes (PEM), très immunogènes, représentent des facteurs de virulence chez les souches d’H. influenzae en particulier chez les souches non capsulées.

Pili ou fimbriae 

La présence de Pili ou fimbriae, mises en évidence chez H. influenzae, confère à la bactérie d es propriétés d’adhésion à la muqueuse nasopharyngée, étape précédant l’invasion sanguine et méningée.
Chez H. influenzae de type b, la piliation permet de définir cinq sérotypes.
Pour H. influenzae de type b, les souches isolées du L CR et du s ang sont le plus souvent non piliées contrairement aux souches isolées du rhinopharynx.

Identification d’Haemophilus influenzae

L’identification formelle d’H. influenzae porte d’abord sur la mise en évidence de l’exigence en facteurs de croissance (facteurs X et V). Différentes méthodes permettent d’étudier cette exigence :
 Le phénomène de satellitisme sur gélose au sang frais avec une strie de Staphylococcus aureus qui réalise un apport en facteur V,
 L’utilisation de milieux supplémentés avec l’un ou l’autre facteur,
 L’utilisation de disques contenant l’un et ou l’autre facteur et qui sont déposés àla surface d’un milieu gélosé.
L’identification sera ensuite complétée par la macroscopie, la microscopie et l’étude des caractères biochimiques présentés dans l’annexe 1). NB :
 Tout apport parasite de facteur de croissance (en particulier X à partir de milieuau sang, flacon d’hémoculture, …) doit être soigneusement évité, de même qu’ilest important pour réaliser ces tests d’utiliser des milieux nutritifs ne contenant aucune trace de ces facteurs.
 Le test de la porphyrine permet d’apporter une certitude quand à la dépendance en facteur X.

Examens macroscopique

Les colonies d’H. influenzae sont lisses, bombées, rondes ou de coloniesmuqueuses, volumineuses ayant tendance à s’étaler.

Examens microscopiques

Ces examens montrent des bacilles à G ram négatif (avec parfois une coloration bipolaire) de petite taille, isolés, polymorphes et parfois capsulés.

Recherche d’oxydase

Un résultat positif se traduit par une coloration violette.Haemophilus influenzae est oxydase positive.

Microméthode d’identification

L’identification par la microméthode est possible grâce à la galerie API NH. (Voir annexe 2 pour la lecture de cette galerie)

Streptococcus pneumoniae

Historique

Isolé de la salive en 1886 par Pasteur, Streptococcus pneumoniae prend la première place parmi les causes de mortalité par maladies infectieuses dans les pays développés.
La découverte en 1916 des différents types sérologiques de S. pneumoniae avait permis l’emploi d’antisérums spécifiques qui furent le premier traitement efficace de lapneumonie à pneumocoque.
L’étude de la physiologie de cette bactérie a co nduit à des découvertes capitales concernant les mécanismes de pathogénicité, la réponse immunitaire à m édiation humorale, les transferts génétiques (découverte de la transformation bactérienne dont l’étude a permis de montrer que l’ADN est le support de l’information génétique), … En 1928, Griffith a montré qu’une souche R (R = rugueux) non c apsulée et non pathogène de S. pneumoniae pour la souris pouvait être transformée en une souche S (S = smooth = lisse), capsulée et pathogène. En 1944, Avery, Mac Leod et Mac Carthy établirent les bases de la génétique bactérienne en montrant que l’ADN est le facteur transformant chez les pneumocoques. Autres dénominations : «Micrococcus pneumoniae », « Diplococcus pneumoniae ». Nom vernaculaire : pneumocoques

Systématique

Dans le « Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology », S. pneumoniae est placé dans le groupe des « Streptocoques pyogènes» ; ce qui peut se justifier compte tenu de la gravité des infections dont il est responsable.

Caractères bactériologiques

Caractères morphologiques

Les souches de S. pneumoniae sont constituées de coques ou de cocco-bacilles, à Gram positif sphériques ou ovoï des (la coloration de Gram se perd dans les vieillescultures et les bactéries peuvent paraître comme des coques à G ram négatif),typiquement groupées par deux et d’allure lancéolée ou en huit mais pouvant se présenter de manière isolée ou en courtes chaînes (les repiquages favorisent la formation de chaînes), capsulés (fortement capsulés à l’isolement).

Caractères culturaux

L’intervalle de température permettant la culture va de 25 à 42°C. En routine, le germe se cultive entre 35 et 37° C. Les cultures sont possibles pour des pH situés entre 6,5 et 8,5, le pH optimal étant de 7,8. Les pneumocoques en culture sont sujets à uneautolyse spontanée ; il conviendra donc de chercher à limiter cette autolyse.
Les milieux employés seront riches, par exemple gélose + sang de mouton à 5 %. Sur ce milieu, le germe développe une hémolyse de type alpha, comme ses proches parents, lesStreptocoques verdissants. La culture est favorisée par une atmosphère de 5 à 10 % deCO2.
L’anaérobiose stricte est encore meilleure pour leur développement et on peut considérer que la gélose au sang placée en anaérobiose est un milieu sélectif qui favorise le développement du pneumocoque.
L’addition d’antibiotique comme la gentamicine ou l ’acide nalidixique rendrait le milieu plus sélectif.

Caractères biochimiques

S. pneumoniae ne possède ni catalase, ni peroxydase, ce qui induit l’accumulation de peroxyde d’hydrogène responsable de son autolyse. Certains caractères biochimiques et enzymatiques permettent de le différencier des autres espèces. (Voir l’annexe 3.2).

Identification de Streptococcus pneumoniae

Elle porte essentiellement sur une étude des caractères morphologiques par des examens macroscopiques et microscopiques, et sur une étude des caractères biochimiques (catalase, sensibilité à l ’optochine, l a lyse par la bile et la mise en évidence de la capsule)

La mise en évidence de la capsule

Elle s’effectue à l’aide de sérum antipneumococcique polyvalent, dirigé contre tous les types capsulaires.
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées :
– la réaction du « gonflement capsulaire » ou réaction de NEUFELD.
– la réaction d’agglutination :
• Agglutination de particules de latex sensibilisées,
• Coagulation avec des particules des staphylocoques tués,
• Contre-immuno-électrique (CIE).
Un résultat positif se traduit par la formation d’agrégats visibles dans le latex contenant le latex anti – Streptococcus pneumoniae (réaction d’agglutination).
L’identification peut être complétée par une étude des caractères biochimiques et enzymatiques (voir annexe 5).