BNGR-HASS
Rappels sur les principes de la Cytométrie en flux Instruments
La cytomètrie en flux (CMF) permet l’analyse de particules en suspension, injectées dans un flux liquide, isotonique. Dans la chambre d’analyse, les cellules passent une à une devant un faisceau laser (fig. 2.1). L’analyse des diffractions dans le prolongement (Forward Scatter, FS) ou latérale (Side Scatter, SS) permet de distinguer les cellules selon leur taille et leur granularité. Les débris (de petites tailles) et les petits amas (doublets), qui peuvent émettre des signaux non spécifiques, peuvent être éliminés par l’analyse électronique.
Les particules en suspension peuvent être identifiées par immuno-marquage utilisant des anticorps couplés à des fluorochromes de couleurs différentes. L’utilisation d’anticorps directement conjugués à un fluorochrome permet d’utiliser plusieurs fluorochromes simultanément, dans la mesure où le chevauchement inévitable des spectres d’émission actuellement disponibles le permette.
Les sources d’excitation laser généralement utilisées sont le laser bleu (Argon ; 488 nm) et le laser rouge (Hélium – Néon ou diode électroluminescente 633 nm). Des lasers UV ou violets peuvent être adjoints. Certains instruments permettent d’utiliser 2 ou 3 lasers différents. Les cytomètres analyseurs actuels comportent de 3 à 6 détecteurs photomultiplicateurs (PMT) qui peuvent mesurer la fluorescence émise par les différents fluorochromes par le jeu de filtres et miroirs sélectifs (fig. 2.2).
Figure 2.2 : Principes de cytomètrie des systèmes utilisés : comparaison des Bancs Optiques soit linéaire (Epics XLM, Beckman-Coulter, Fullerton CA) soit en étoile : octogone et trigone (FACSCanto , BD Biosiences, San Jose, CA). Fluorochromes : Les fluorochromes les plus couramment utilisés sont la Fluorescéine (FITC), la Phycoérythrine (PE),
la Protéine Péridine Chlorophylle (PerCP) et Alexa 488 pour le laser Argon et Allophycocyanine (APC), Alexa 647 pour le laser Helium-Néon (table I). Les fluorochromes sont activés à une longueur d’onde caractéristique et émettent un spectre de longueurs d’onde plus élevées (fig. 2.3). Figure 2.3 : Principes d’immunofluorescence en cytométrie (fluorochromes disponibles) : Répartition des spectres d’excitation et d’émission de chaque fluorochrome utilisé.
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