Etude des performances de 8 tests rapides de diagnostic de l’infection a VIH

RAPPEL VIROLOGIQUE ET MOLECULAIRE

Le VIH est un lentivirus appartenant à la famille des retroviridae. Deux types de VIH ont été identifiés : VIH-1 et VIH-2 mais VIH-1 est plus souvent incriminé dans la survenue du SIDA.
VIH-2 diffère du VIH-1 par sa structure génomique et par son antigénicité ; mais comme le VIH-1, est responsable de SIDA

MORPHOLOGIE

Les VIH sont des virus enveloppés de forme plus ou moins sphérique avec 80 à 120 nm de diamètre,cerclés par une enveloppe faite de couche lipidique à la surface de laquelle sortent des boutons. [21]
L’enveloppe est limitée à l’intérieur par une membrane de 5-6 nm d’épaisseur servant de pont entre la nucléocapside et les glycoprotéines de l’enveloppe (gp120 – gp 41). Au coeur de la forme sphérique, se trouve le core (P24) recouvert d’une couche protéique (p17).
Entre l’enveloppe et le core se trouvent les corps latéraux.

VARIABILITE GENETIQUE 

La variabilité génétique du VIH fut reconnue très tôt après sa découverte. Dès 1986, on connaissait l’existence de 2 sous-types de virus ; le VIH-1, sous-type le plus répandu dans le monde, et le VIH-2 à localisation restreinte, en majorité en Afrique de l’Ouest.
Certaines protéines du virus sont plus particulièrement touchées par cette diversité génétique.
C’est le cas de la SU gp120 . Les analyses génétiques d’une région variable de la SU gp120 des VIH ont abouti à l’élaboration d’un arbre « généalogique » des VIH fondé sur l’éloignement génétique des enveloppes virales.
Le degré de divergence entre les deux types de virus VIH-1 et VIH-2 atteint plus de 50%.
Chaque type de virus est lui même représenté par des virus génétiquement éloignés. Ainsi le groupe VIH-1 est divisé en trois groupes de virus : les VIH-1 du groupe M (Majoritaire), qui correspondent aux virus les plus répandus dans le monde, les VIH-1 du groupe O ( Outlier) identifiés au Cameroun et le groupe N (non M non O) identifié en 1998. Les VIH-1 du groupe M sont eux-même représentés par différents sous-types désignés par des lettre allant de A à K.
Ce virus peut être pur (un seul sous-type) ou recombinant provenant de la formation de matériel génétique hybride lors de la rétro transcription de leur génome dans une cellule coinfectée . D’autres mécanismes sont également responsables. Parmi ceux-ci, les pressions de sélection exercées par des contrôles de la réplication de certaines formes virales chez l’hôte sont à prendre en considération.
La classification génétique constitue un outil précieux pour la surveillance épidémiologique des infections par le VIH dans le monde. Cette surveillance est essentielle ; elle peut permettre, et a déjà permis, la réactualisation de méthodes fiables en matière de diagnostic de ces infections.

Les conséquences de la diversité génétique sur le diagnostic

Les tests diagnostiques ont été développés dans les pays industrialisés (Europe occidentale et Amérique du Nord ), donc sur la base d’infections par le sous-type B.
Cependant avec la diversité génétique, ces tests ont montré leur limite. C’est ainsi que les VIH-1 du groupe O ont été initialement identifiés parce qu’ils n’avaient pas été détectés par certains tests sérologiques commerciaux. Ces sérums du groupe O peuvent donner des résultats indéterminés avec les tests de confirmation habituels tels que le western-blot [33]
Actuellement la majorité des tests commerciaux sont capables de détecter les anticorps antigroupe O, soit par l’usage de la réactivité croisée des antigènes spécifiques du groupe M, soit par l’addition des antigènes spécifiques du groupe O. Cependant une surveillance continue est nécessaire, puisque des changements subtils dans la structure antigénique de certains variants des VIH peuvent affecter la sensibilité des tests. Il a été également démontré que pendant la séroconversion, une plus faible sensibilité est observée pour la détection des infections dues aux sous types non-B en utilisant les tests de dépistage basés sur les antigènes du sous-type [3]
La variabilité génétique a aussi des conséquences sur la mesure de la charge virale.
Les trousses disponibles ne peuvent quantifier que les VIH-1 groupe M. Elles ne détectent ni VIH-2, ni VIH-1 groupe O.
Ces tests ont été réévalués et d’autres tests sont en cours de développement.
Compte tenu de la grande diversité des souches des VIH, ces tests nécessitent une mise à jour continue afin d’évaluer l’efficacité des amorces et des sondes utilisées.

CYCLE REPLICATIF 

Il comporte des événements précoces aboutissant à l’intégration du génome viral dans celui de la cellule hôte et des événements plus tardifs dont résulte la formation de nouveaux virions.
L’infection par le VIH commence par la fixation de la particule virale sur la molécule CD4 et sur son corécepteur (de la famille des récepteurs de chimokine).
L’enveloppe virale est un complexe composé d’une sous unité transmembranaire la gp41 et d’une sous unité externe la gp120. Ces deux sous unités dérivent du clivage protéolytique de laprotéine précurseur la gp160. Ce complexe est exprimé sous forme d’une structure trimérique faite de trois paires de gp120/gp41.
Ce complexe prépare un processus à plusieurs stades de fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de la cellule cible.
La première étape est la fixation de la gp120 sur la molécule CD4 [55] ; ceci introduit son changement de conformation qui entraîne une fixation secondaire de la gp120 sur ce récepteur de chimokine.
Cette fixation entraîne un changement de conformation de la gp41 qui s’insère dans la membrane de la cellule cible, entraînant la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de la cellule cible.
Plus de 7 récepteurs différents de chimokine ont été identifiés comme corecepteurs pour l’entrée du VIH.
De plus, chez plusieurs individus infectés par le VIH, on note une évolution de la production des virus qui utilisent le CCR5 au début de l’infection à des virus qui utilisent le CXCR4 [17] aux stades avancés de l’infection.
Après l’entrée du virus dans la cellule, il y a la rétro transcription de l’ARN viral en un ADN complémentaire grâce à la transcriptase inverse. Cet ADN s’intègre dans celui de la cellule au niveau des régions LTR ; tous deux seront clivés par une seconde enzyme, l’intégrase virale.
Après cette intégration, plusieurs étapes peuvent se dérouler :
• transcription de l’ADN proviral par l’ARN polymérase II cellulaire, sous l’action de facteurs cellulaires
• Augmentation de la quantité d’ARN viraux dans le noyaux de la cellule par la protéine de régulation tat.
• transport de cet ARN sous le contrôle de la protéine rev
Après ces différentes étapes, les ARN messagers viraux (ARNm) sont traduits en protéines virales dans le cytoplasme de la cellule. Ceux de petite taille donneront les protéines de régulation des VIH tandis que ceux de taille moyenne et complète donnent les protéines de structure issues des gènes gag, pol et env. Il s’ensuit éventuellement une glycosylation, puis un assemblage des protéines virales aboutissant à la formation de nouveaux virus bourgeonnant à la surface de la cellule. La connaissance de ces mécanismes complexes qui résultent en la fabrication de virus par la cellule infectée est particulièrement importante puisque c’est sur elle que repose le développement de stratégies diagnostiques thérapeutiques.

PHYSIOPATHOLOGIE DE L’INFECTION A VIH

Le VIH entraîne une destruction du système immunitaire de l’hôte et la réponse immune de ce dernier est incapable d’éradiquer l’infection.
En effet l’infection commence par une phase aiguë, partiellement contrôlée par la réponse immune adaptative puis progresse vers une infection chronique des organes lymphoïdes périphériques.

CINETIQUE DES MARQUEURS LORS D’UNE INFECTION PAR LE VIH 

12 semaines après l’infection, la charge virale est réduite à des niveaux très bas uniquement détectables par des techniques de grande sensibilité telle que la PCR et reste constante plusieurs années. De même, les taux de CD4+ diminuent progressivement durant cette période de latence clinique à cause de la réplication virale très active. Quand ces taux atteignent des valeurs critiques ( environ 200/mm3), les risques d’infections opportunistes sont très élevés.

DIAGNOSTIC INDIRECT

Il repose sur la mise en évidence des anticorps spécifiques des protéines virales. Ces dernières étant immunogènes, vont induirent la production d’anticorps chez le sujet infecté.
De nombreuses méthodes existent pour le dépistage de ces anticorps.

LES TESTS DE DEPISTAGE

TECHNIQUES IMMUNOENZYMATIQUES

L’ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) est la technique immuno enzymatique la plus couramment utilisée pour la recherche d’anticorps anti-VIH. Simple, rapide, sensible et spécifique, elle s’adapte au dépistage de grandes séries de sérums sous forme de nombreuses trousses commercialisées. Cependant, avec les différences épidémiologiques d’une région à une autre et d’un groupe de population à un autre, leur évaluation préalable est nécessaire pour le choix du test appropriée à chaque situation.
Plusieurs épreuves ELISA existent dont trois catégories couramment utilisées

ELISA INDIRECT (figure VI)

Le sérum est ajouté à la phase solide contenant l’antigène et le tout est incubé pendant une période et à une température spécifique.
La réaction antigène-anticorps est révélée par un conjugué couplé à une enzyme. La densité optique est d’autant plus élevée que la concentration d’anticorps est grande.

ELISA PAR COMPETITION (figure VII)

On ajoute en même temps à la phase solide l’échantillon et le conjugué. L’anticorps anti-VIH du sérum entre en compétition avec le conjugué (qui est un anticorps dirigé lui aussi contre l’antigène VIH) pour occuper les sites réactifs sur l’Ag lié.
Ici, la quantité inconnue d’anticorps présents dans l’échantillon sera inversement proportionnelle à l’intensité de coloration produite.

EVOLUTION DES REACTIFS ELISA

Depuis la découverte du VIH jusqu’a nos jours, plusieurs générations d’ELISA se sont succédées dans le but d’améliorer les performances des réactifs. Ces améliorations concernent principalement la source d’antigène VIH utilisée et le principe de la technique ELISA.

LES TESTS ELISA DE PREMIERE GENERATION

Ce sont des épreuves fondées sur des antigènes dérivés de lysats viraux occasionnant parfois de fausses réactions positives. Ceci s’explique par la présence d’éléments contaminants d’origine cellulaire dans laquelle le virus a été propagé.
Si un échantillon inconnu contient des anticorps qui réagissent avec ces éléments contaminants, une réaction faussement positive est possible.

LES TESTS ELISA DE DEUXIEME GENERATION

Ils utilisent comme source antigénique soit des protéines recombinantes, soit des peptides synthétiques.
Les antigènes recombinants sont produits par l’introduction d’une portion du génome HIV dans le vecteur biologique (généralement Escherichia coli) donnant lieu à la production du gène (antigène) par le véhicule ainsi modifié. Comme ce dernier se multiplie rapidement on peut produire ainsi de grandes quantités de ce gène.
Les antigènes synthétiques sont fabriqués en laboratoire à partir d’un pool d’acides
aminés libres après avoir déterminé la séquence des acides aminés de l’antigène à utiliser.
Ces acides aminés se combinent dans le même ordre que ceux de l’antigène original.
Ces antigènes recombinants et synthétiques, obtenus de façon plus simple et plus reproductible, ont permis d’améliorer la spécificité des tests.