Les techniques analytiques

Les techniques analytiques

La spectrométrie de masse

Afin d’étudier les profils protéiques exprimés dans différentes conditions physiologiques ou pathologiques, l’analyse par MS est couramment utilisée comme outil puissant sur les plateformes de protéomique. Cette technologie est appliquée pour la détermination de masses et peut être adaptée à l’identification des protéines. Un spectromètre de masse sépare les protéines (ou autres analytes) en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z). Les molécules à analyser sont ionisées et les ions sont envoyés vers l’analyseur par un champ électrique qui sépare ces ions en fonction de leur rapport m/z. Le détecteur envoie alors l’information vers l’ordinateur pour être analysée. Les méthodes d’ionisation fréquemment utilisées en biologie sont l’électrospray (ESI) et la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) car elles engendrent peu ou pas de fragmentation de la molécule durant le processus d’ionisation et/ou de désorption.

Les sources d’ionisation a ESI

L’ionisation par électrospray a été développée par Fenn et ses collaborateurs, et décrite pour la première fois en 1985 [24]. L’ESI a été depuis très largement utilisée en protéomique (et pour d’autres applications) pour la caractérisation de biomolécules spécifiques. L’électrospray implique la production d’ions gazeux grâce à l’application d’un potentiel électrique à un liquide en mouvement, ce qui résulte en la formation d’un spray de petites gouttelettes, mélange de solvant et d’analytes.

Le solvant est évaporé des gouttelettes par la chaleur ou par une autre forme d’énergie comme celle provenant de la collision avec un gaz (azote). La taille de la goutte diminue de plus en plus jusqu’à devenir instable (limite de Rayleigh), ce qui induit l’implosion en gouttelettes encore plus petites. Finalement les répulsions électrostatiques deviennent assez fortes pour provoquer la désorption des ions analytes, qui sont alors envoyés vers le spectromètre de masse (Figure 2). Les ions générés en ESI portent généralement plusieurs charges et sont de type (M+nH)n+ .

MALDI

En 1988, Hillenkamp et Karas découvrent que l’on peut produire des ions moléculaires de larges protéines par désorption laser sans fragmentation lorsque ces biomolécules sont mélangées avec une matrice [28]. Il s’agit d’une structure cristalline de petites molécules organiques chromophores. La longueur d’onde du laser utilisé pour l’ionisation doit être dans la gamme d’absorption des cristaux de matrice. Grâce à l’absorption des photons du laser, des petites molécules de matrice sont vaporisées et désorbent avec elles les plus grosses molécules de protéines.

Aujourd’hui encore, l’ionisation MALDI n’est pas totalement bien décrite. Différents modèles ont été proposés : • modèle d’ionisation photochimique [29], • modèle d’ionisation par cluster [30], • modèle par pseudo-transfert de proton [31]. Pour le modèle d’ionisation photochimique, l’ionisation multiphotonique suivie de collisions permet la production d’ions de matrice par photoionisation, protonation et déprotonation. Les ions biomoléculaires sont produits par protonation et déprotonation avec des ions de matrice et/ou d’autres biomolécules lors de processus de collisions en phase gazeuse.

Pour le modèle d’ionisation par cluster, l’irradiation laser provoque la désorption de cluster d’ions qui produisent alors des ions biomoléculaires par expulsion des molécules de matrice. Pour le modèle de pseudo transfert de proton, les ions biomoléculaires sont produits pendant le processus de cristallisation, l’absorption de l’énergie laser permettant uniquement la désorption dans l’espace pour la détection par spectrométrie de masse. Une meilleure compréhension des mécanismes d’ionisation pourrait devenir essentielle à l’amélioration de la détection par spectrométrie de masse. Aujourd’hui, le MALDI est très efficace pour la détection de peptides