NOUVELLES METHODES DE DIAGNOSTIC

Bactériologie

Spectrométrie

Récemment sont apparus sur le marché des spectromètres de masse fondés sur la technologie MALDI-TOF (matrixassisted laser désorption/ionisation-time-of-flight) utilisant des bactéries entières et permettant l’identification bactérienne au rang d’espèce par comparaison des pics protéiques obtenus avec les banques de données. Ces solutions d’identification présentent l’intérêt majeur d’être très rapides (quelques minutes) et de pouvoir tester très facilement plusieurs colonies d’une même boîte Figure 10: Principe de l’identification bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF (https://www.google.com/www.sante publique France. Media-a-missions-maldi-tof -dortet ) Le dépôt peut être réalisé sous deux formes ; soit on part directement de la culture bactérienne, soit on effectue au préalable une extraction des protéines.

Quelle que soit la méthodologie choisie, le dépôt est réalisé sous forme d’une couche mince sur un support, puis recouvert de la matrice donneuse d’électron ; le tout sera ensuite bombardé par un faisceau laser. Un profil moyen est alors obtenu. Le spectromètre génère automatiquement la liste des pics obtenus de tous les spectres et extrait les pics typiques présents dans un certain nombre de spectres d’une seule espèce. Selon les différentes études publiées jusqu’à maintenant, 95 à 97,5 % des bactéries isolées dans les laboratoires de microbiologie sont identifiées correctement à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Ces résultats sont comparables (voire meilleurs) à ceux obtenus avec des automates utilisant des méthodes conventionnelles [10].

Galeries miniaturisées et automates d’identification bactérienne

Actuellement, les tests biochimiques d’identification sont effectués plus souvent sur des automates. Ces automates permettent la réalisation des antibiogrammes en milieu liquide pour la plupart des germes courants. Les tests utilisés correspondent à la plupart de ceux précédemment décrit. Les méthodologies utilisées dépendent des fabricants. Exemple Les systèmes Vitek® technology (bioMérieux) (figure 10) utilisent des cartes plastiques renfermant des microcupules, chaque cupule contenant un substrat spécifique déshydraté. Une quarantaine de substrats sont testés. Les cartes sont identifiées par un code à barres précisant le type de carte (carte Gram positif, carte Gram négatif, carte anaérobies…). Les tests varient bien évidemment en fonction des cartes et, sur ce principe, plus de 120 espèces peuvent être identifiées pour les Gram positif et plus de 150 pour les Gram négatif fermentant et non fermentant. Un algorithme d’interprétation est ensuite utilisé par l’appareil pour associer à un taxon particulier des résultats de métabolisme biochimique. 

Méthodes moléculaires

Les méthodes moléculaires, en particulier fondées sur les réactions de polymérisation en chaîne (PCR), sont utilisées depuis quelques années par les laboratoires et permettent en particulier de diagnostiquer des infections dues à des bactéries non ou difficilement cultivables sur milieux classiques ou de croissance lente. Elles permettent également de mettre en évidence le portage de certaines bactéries et peuvent s’appliquer directement sur le produit pathologique ou bien à partir des cultures. Ces méthodes sont utilisées pour détecter un pathogène en particulier. Cette dernière approche dite par « PCR universelle » permet d’amplifier une cible retrouvée chez toutes les espèces bactériennes. L’identification de l’espèce en cause sera alors fondée sur le séquençage du fragment amplifié, puis la comparaison de la séquence obtenue avec les banques de données.