Variation du signal FISH au cours du cycle cellulaire

 Variation du signal FISH au cours du cycle cellulaire

Une connaissance précise de la population bactérienne tant d’un point de vue taxonomique que quantitatif est un élément essentiel en écologie microbienne. En effet cette discipline repose sur les interactions entre les différents microorganismes et leur environnement. Il y a encore peu de temps, l’identification était principalement basée sur des observations microscopiques ou des méthodes de culture. L’émergence de la biologie moléculaire a permis de fournir de nouveaux outils aux microbiologistes. La PCR permet une identification, en offrant la possibilité de révéler la présence ou l’absence d’un microorganisme cible dans un échantillon. La PCR en temps réel permet de rajouter un aspect quantitatif. Des techniques couplées à la réaction de polymérisation en chaîne, telles que la DGGE ou la TTGE, permettent de dresser un profil de la population, et ainsi de déterminer les espèces présentes en comparant le profil obtenu par rapport à un référentiel constitué à partir de souches pures. L’hybridation in situ est très certainement la technique la plus employée en écologie microbienne pour la caractérisation des microorganismes. En plus de l’identification, elle offre également la possibilité de localiser les bactéries au sein de leur environnement, mettant ainsi en évidence leurs interactions. En ce qui concerne l’écosystème des boues activées, la population bactérienne est l’élément central puisque c’est sur elle que repose l’activité épuratrice. La caractérisation de cette population bactérienne est donc importante pour les chercheurs, mais également pour les exploitants de station. C’est en effet d’elle que va dépendre la qualité de l’eau qui sera rejetée dans le milieu naturel. Le profil de la population bactérienne dépend de nombreux facteurs tels que la nature et l’abondance des substrats disponibles, ou encore l’aération. Elle fournit donc des informations sur la composition des eaux usées et sur les éventuels dysfonctionnements de la station de traitement. Un des problèmes les plus fréquemment rencontrés dans les stations d’épuration à boues activées est le phénomène de bulking. Comme cela a précédemment été expliqué, il résulte d’une prolifération rapide et excessive de bactéries filamenteuses, aboutissant à l’impossibilité de séparer les matières en suspension de l’eau épurée. À l’heure actuelle, très peu de moyens sont disponibles pour évaluer les populations de bactéries filamenteuses dans les boues. Seules les observations microscopiques et les mesures d’indice de boue permettent de les estimer mais avec un degré d’anticipation quasiment nul par Variation du signal FISH au cours du cycle cellulaire Chapitre III : Résultats et Discussions 228 rapport à la survenue d’un épisode de prolifération filamenteuse. Bien que quelques études utilisant la PCR quantitative aient été réalisées (Kaetzke et al., 2005; Vervaeren et al., 2005), la technique d’hybridation fluorescente in situ reste actuellement la plus utilisée pour quantifier les bactéries filamenteuses sur des échantillons de boues activées (Gaval et al., 2002; Gaval & Pernelle, 2003; Hug et al., 2005). Dans ces cas, la technique est utilisée afin de quantifier les différentes populations filamenteuses dans les boues ainsi que la taille des filaments. C’est de cette manière que Gaval et al. (2002, 2003) ont mis en évidence une brusque augmentation du nombre de filaments de certaines espèces bactériennes après application d’un stress comme une carence en oxygène, suivie d’une diminution tout aussi rapide des effectifs après arrêt du stress (Gaval & Pernelle, 2003). Lors de l’application de stress en série, la population filamenteuse émergeante est à chaque fois plus importante (cf. Figure 96). Cependant, il y a toujours une décroissance rapide de la population filamenteuse consécutive à l’arrêt du stress. Ce phénomène a été observé pour différentes espèces de bactéries filamenteuses et notamment Thiothrix nivea, Thiothrix eikelboomii (Eikelboom type 021N), Haliscomenobacter hydrossis et Sphaerotilus natans. 

Évolution de l’intensité du signal FISH lors du cycle de croissance

Sphaerotilus natans Nous avons dans un premier temps réalisé des cultures pures de la souche Sphaerotilus natans 29330 en réacteur. Nous avons choisi cette souche car c’est la seule de l’espèce S. natans qui soit capable de croître principalement sous forme monocellulaire dans ces conditions, permettant ainsi une analyse par cytométrie en flux. L’inoculum utilisé pour ensemencer les réacteurs est préparé à partir d’une culture de cellules dispersées et âgée de 16 heures. Les conditions de culture sont indiquées dans le chapitre Matériels et Méthodes. Lors de ces cultures nous avons réalisé différents prélèvements afin d’établir la courbe de croissance des microorganismes (cf. Figure 98). La courbe a été déterminée en utilisant deux techniques distinctes :  le marquage des cellules au cFDA et le dénombrement en cytométrie en flux  la mesure de la turbidité à 600 nm. Chapitre III : Résultats et Discussions 231 0,E+00 5,E+07 1,E+08 2,E+08 2,E+08 3,E+08 0 5 10 15 20 25 30 35 Temps (heure) concentration en cellules (cellules.mL-1 ) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Turbidité 600 nm Figure 98 : Courbes de croissance de la souche S. natans 29330 lors d’une culture en réacteur déterminées par cytométrie en flux (♦) et mesure de la turbidité à 600 nm (♦). Les deux techniques donnent des courbes de croissance très similaires. On note cependant que par cytométrie en flux, la population estimée après 31 heures de culture, c’est-à-dire 12 heures après l’entrée en phase stationnaire, diminue alors que celle estimée par mesure de la turbidité à 600 nm reste stable. Ceci peut s’expliquer par le fait que seules les cellules vivantes possèdent l’activité enzymatique estérase nécessaire au clivage du cFDA en cF, qui émet la fluorescence. Après la phase stationnaire, la culture bactérienne entre dans une phase de déclin, qui correspond à une augmentation de la mortalité cellulaire. Le nombre de cellules vivantes diminue, ce que reflète le dénombrement par cytométrie en flux. La mesure de densité optique quant à elle ne traduit pas, au moins dans un premier temps, cette mortalité. Les cellules mortes et les débris cellulaires, vont contribuer à maintenir une valeur de turbidité élevée. Nous avons donc choisi, pour la suite des travaux, d’établir la courbe de croissance en utilisant la technique de dénombrement par cytométrie en flux. Il faut également noter que seule une très brève phase de latence est observée. Ceci peut s’expliquer par le fort taux d’ensemencement du réacteur (près de 1.106 cellule.mL-1), et par le fait que les bactéries étaient en pleine phase exponentielle de croissance au moment de leur injection dans le réacteur Parallèlement à la courbe de croissance, nous avons mesuré l’intensité du signal FISH par cellule (cf. Figure 99). Un marquage en milieu liquide a donc été réalisé pour chacun des échantillons selon le protocole décrit dans le chapitre Matériels et Méthodes. L’hybridation a été effectuée à l’aide de la sonde EUB 338 et l’intensité de fluorescence par cellule a été déterminée par cytométrie en flux.