Protocoles Nanopores

Protocoles Nanopores

 Production des molécules d’ADN 

Liste des oligos d’ADN Oligos utilisés pendant la thèse, conservés à −20˚C dans TE pH7.4. NOM SEQUENCE c-RLS 5’CCTGAACAGTGAGCGAAGCCCGGCGCGGACAAAATGCCGCAGCCTA30-3’ 75pb RLS 3’-GGACTTGTCACTCGCTTCGGGCCGCGCCTGTTTTACGGCGTCGGA-5’ 45pb c-SLS 5’-CGTAGTTCGTGCGTGGAGATCTGCCTCCGTGGCCTCGCGCAGCCTA30-3’ 75pb SLS 3’-GCATCAAGCACGCACCTCTAGACGGAGGCACCGGAGCGCGTCGGA-5’ 45pb hpc 5’-CGCAGCCT(A)−30-3’ 38pb hp1 5’-AGGCTGCGGCGTCGGATA GTTG TATCCGACGC-3’ 32pb hp2 5’-AGGCTGCGATTCGTCCTG GTTG CAGGACGAAT-3’ 32pb hp3 5’-AGGCTGCGATCTGTTCGT GTTG ACGAACAGAT-3’ 32pb hp4 5’-AGGCTGCGTTATCGGTTC GTTG GAACCGATAA-3’ 32pb hp5 5’-AGGCTGCGAAATGCTGTT GTTG AACAGCATTT-3’ 32pb Les oligos sont suspendus dans une solution de TE 1x pH7.4 à 200µM. La concentration est vérifiée en mesurant l’absorbance à 260nm d’une dilution connue de ces suspensions.

 Production des hairpins Hp1 à 5

La longueur totale de la molécule dépliée faisant 70 paires de base, les fournisseurs d’oligos déconseillent la production en une étape de la molécule. Nous avons donc choisi de produire la molécule en deux étapes, en séparant la partie commune à toutes les molécules (hpc, 38 pb) de la partie variable (hp1 à 5, 32pb). Ainsi l’oligo hpc est mélangé en proportion 1.5/1 avec un oligo hpx complémentaire. Le léger excès de molécule hpc permet de s’assurer que les molécules qui n’ont pas réagi ne forment pas de hairpins qui pourraient gêner les mesures de nanopore. Hpc, s’il est présent en excès, va passer dans l’hémolysine beaucoup plus vite Protocoles Nanopores 16.2 Réalisation des expériences d’ouverture en pore unique 189 Figure 16.1 – Gel de polyacrylamide dénaturant de contrôle de ligation. Les puits sont, de gauche à droite : ladder low M (difficilement visible) / ladder 50pb / hp3+hpc + ligase / hp3+hpc – ligase / hp5+hpc + ligase / hp5+hpc – ligase que les hairpins complets et sera facilement exclu de l’analyse des signaux de translocation. Une ligation est alors effectuée pour les hybrides hpc/hpx. La ligation est vérifiée sur gel de polyacrylamide dénaturant (figure 16.1). En présence de ligase, nous obtenons bien des molécules plus grandes et nous vérifions l’absence de molécules hpx résiduelles (pour une raison que l’on ignore, l’oligo hpc de 32 paires de bases n’est pas visible car il n’est pas marqué par le BET). Le gel n’est qu’un gel d’analyse, nous ne purifions pas les molécules sur gel de polyacrylamide. Avant utilisation dans les nanopores, les molécules subissent un quench thermique (chauffage 5 minutes à 90˚C puis plongeon dans la glace). Ce quench permet d’éliminer la présence éventuelle de concatémères. 16.1.3 Production des duplex λ-RLS et λ-SLS Les longs duplex sont fabriqués plus simplement. Il suffit d’hybrider des deux oligos complémentaires en condition équimolaire.

Réalisation des expériences d’ouverture en pore unique

Présentation du montage (figure 16.2)

Le montage expérimental n’est pas tout à fait standard pour ces expériences de translocation car le dispositif est placé sous microscope inversé, ce qui s’avèrera pratique pour vérifier la qualité de la bicouche lipidique. Une cellule en Teflon séparant deux compartiments (cis et 190 Protocoles Nanopores Figure 16.2 – Photo du montage expérimental. Le microscope est placé dans une grande cage de Faraday. La cellule en Teflon est placée au centre d’une plus petite cage de Faraday. trans) pouvant contenir du tampon est percée par une fine membrane de Teflon percée par un trou de 30µm. Ce dispositif est placé sur un microscope inversé et recouvert par une cage de Faraday. Deux électrodes d’argent (WPI) sont connectées à la cellule de Teflon du coté cis et trans et à un préamplificateur relié à l’appareil Axopatch 200. L’Axopatch permet la mesure du courant à travers la membrane, il permet de contrôler les paramètres d’acquisition et de fixer la différence de potentiel entre les électrodes d’argent. 16.2.2 Préparation des aliquots d’alpha hémolysine Préparer : – une soixantaine de tubes eppendorf (0.5mL), – une fiole de toxine d’alpha hémolysine (Sigma Aldrich, H9395), – une seringue de 1mL avec une aiguille stérile, – 1mL d’une solution d’éthylène glycol (50% w/v) Puis : – enlever le sceau métallique sur la fiole d’hémolysine – mettre 0.5mL d’éthylène glycol dans la seringue – percer le bouchon en caoutchouc de la fiole à l’aide de la seringue (la seringue se vide d’elle même car la fiole est sous vide) – dissoudre tous les agrégats de protéines et attendre quelques minutes – ouvrir délicatement la fiole et faire des aliquots de 8µL de la solution dans les tubes eppendorf – garder les aliquots au congélateur.