La surveillance des antipaludiques est un outil puissant de lutte contre le paludisme

La surveillance des antipaludiques est un outil puissant de lutte contre le paludisme

En testant directement les réponses aux médicaments antiparasitaires ou en étudiant les mutations génétiques associées à la résistance, nous pouvons être avertis rapidement de la baisse de sensibilité des parasites aux médicaments utilisés dans les associations thérapeutiques avant que les parasites ne deviennent très résistants et ne provoquent un échec thérapeutique. Les CTA étant le traitement de première intention dans toute l’Afrique, la capacité à détecter la résistance aux dérivés de l’Artémisinine et aux composés partenaires au fur et à mesure que leur apparition deviendra de plus en plus important pour préserver l’efficacité de ces médicaments. (Van Tyne et al., 2013). C’est dans ce cadre que nous avons mené cette étude dans le but de contribuer à la surveillance de la sensibilité de Plasmodium falciparum aux molécules antipaludiques (Chloroquine, Pipéraquine, Amodiaquine, Luméfantrine, Méfloquine et Quinine) utilisées au Sénégal. Le test ex vivo a été utilisé pour étudier la sensibilité des isolats de Plasmodium aux molécules antipaludiques. La HRM nous a permis de faire les génotypages des marqueurs moléculaires de résistance. Afin de s’assurer de l’efficacité des antipaludiques, nous avons porté notre choix sur deux techniques qui s’accommodent particulièrement bien au contexte Africain. Il s’agit de l’ex vivo test et de HRM. Le SYBR Green-test nous a permis de faire des tests ex vivo et la HRM nous a permis d’évaluer l’efficacité d’une panoplie d’antipaludiques : la Chloroquine, la Pipéraquine, l’Amodiaquine, la Luméfantrine, la Méfloquine et la Quinine. Nos résultats ont montrés une bonne efficacité de toutes les molécules antipaludiques utilisées et si cette tendance est observée pour ceux qui sont des dérivés d’Artémisinines, nous pouvons supposer que les CTA gardent leur bonne efficacité. Ceci est d’autant plus plausible que sur in vivo où de rares échecs thérapeutiques sont rapportés. Toute fois l’augmentation la prévalence de l’haplotype NFD soulève quelque inquiétude aux vues de son implication supposée dans la résistance à l’Artéméther-Luméfantrine. En perspective, il serait souhaitable d’élargissement cette étude dans d’autres localités du pays où la transmission est élevée notamment dans le Sud et le Sud-Est et d’étudier toutes les molécules antipaludiques et leur combinaison. Nous envisageons une étude plus approfondie pour la Pipéraquine qui est peu étudiée. Il serait également très intéressant d’étudier l’Artémisinine et ses dérivés en faisant appel à des techniques telles que la RSA (Ring Survival Assay) et le séquençage.

Critères d’inclusion Les critères d’inclusion sont les suivants 

Infection à P. falciparum uniquement, confirmée par une goutte épaisse et un frottis mince ; – Densité parasitaire comprise entre mille (1000) et (200000) formes asexuées/μl de sang ; Molécule Gene Codon Chloroquine Pfcrt Lys76Thr Amodiaquine pfmdr1 Asn86Tyr Pfmrp His191Tyr et Ser437Ala Méfloquine pfmdr1 Nombre de copie > 1 SulfadoxinePyriméthamine Pfdhfr Ser108Asn Pfdhfr Triple mutation : Ser108Asn + Asn51Ile + Cys59Arg Pfdhps Ala437Gly Pfdhps Double mutation : Ala437Gly + Lys540Glu Quintuple mutation : Ser108Asn (dhfr) + Asn51Ile (dhfr) + Cys59Arg (dhfr) + Ala437Gly (dhps) + Lys540Glu (dhps) Pfmrp Lys1466Arg Proguanil (cycloguanil) Pfdhfr Ser108Thr + Ala16Va Pfdhfr Double/triple mutation : Ser108Asn + Asn51Ile et/ou + Cys59Arg Atovaquone Pfcytb Tyr268Asn ou Tyr268Ser Luméfantrine pfmdr1 Asn86 & Nombre de copie > 1 Quinine pfnhe-1 (ms4760) Nombre de motifs : DNNND > 2 ou NHNDNHNNDDD < 3 Pfmrp His191Tyr et Ser437Ala Doxycycline pftetQ Nombre de motif KYNNNN <3 pftetQ Nombre de copie >1 Pfmdt Nombre de copie >1 Artemisinin Pfserca, pfk13 Ser769Asn, C580Y pfdhfr + pfdhps d – Absence de signes généraux de danger ou d’autres signes de paludisme à P. falciparum grave et compliqué tels que définis par l’OMS (WHO, 2000) ; – Fièvre ou histoire de fièvre dans les 48 h ; – Absence d’antécédents de réactions d’hypersensibilité aux médicaments évalués ; – Âge compris entre 2 et 75 ans – Vivant dans un rayon de 10 km de la structure sanitaire – Consentement éclairé et signé Critères de non inclusion Les critères de non inclusion sont les suivants : – Absence de consentement du malade, de ses parents ou de ses tuteurs ; – Accès difficile à la structure sanitaire ; – Critères d’exclusion propres à certains médicaments ; – Grossesse et allaitement – Âgé moins de deux (2ans) Les patients ayant rempli les critères d’inclusion étaient invités à participer à l’étude par le biais d’un consentement écrit. Afin de conserver la confidentialité des inclus, un code connu seulement par les responsables de l’étude était utilisé en guise d’identification. Préparation et supplémentation du milieu RPMI Pour la préparation du milieu RPMI, nous avons besoin de l’eau distillée, du RPMI en poudre, de l’HEPES, de la Gentamicine, de l’Hypoxanthine, du chlorure d’hydrogène, un erlenmeyer, un agitateur magnétique et de la soude (NAOH 5N). Pour une préparation d’un litre de solution, nous dissolvons dans 750 ml d’eau distillée 10,44 g de RPMI et 5,94 g d’HEPES. Ensuite, 0,05 g d’Hypoxanthine, complètement dissout dans 1ml de soude et diluée au 1/10 et 0,5 ml de gentamicine sont ajoutés dans la solution. Nous complétons les 25 ml d’eau distillée restante et ensuite le pH est réajusté à 6,75. Enfin la solution est stérilisée par filtration et est conservée à +40°c. Cette solution ne pourra être utilisée que pour le lavage de culot globulaire ou la dilution de solution d’antipaludique. La supplémentation est réalisée par addition, dans 1litre de milieu RPMI, de sérum humain inactivé à la chaleur (50 ml), de l’Albumax II à 5% (50 ml) et du bicarbonate de sodium à 3,6% (60 ml).

EXTRACTION ADN 

L’extraction de l’ADN parasitaire est faite à partir du papier filtre collecté à l’aide du Mini Kit QIAamp DNA (QIAGEN, Valencia, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. La paillasse et l’ensemble des matériels à utiliser sont nettoyés à l’alcool 70° avant toutes manipulations. Découper dans chaque tube eppendorf de 2 ml unique pour chaque numéro environ 3 mm2 du confetti. Il faudra toujours nettoyer le ciseau avant de couper un autre confetti. Dans chaque tube eppendorf, nous ajoutons 180μl de tampon ATL avant de faire une incubation de 10 minutes à 850C. Après cette phase, 20μl de protéinase K sont ajoutés dans le tube, bien mélanger par vortex, brièvement centrifuger et incuber à 560C pendant 1 heure. Ensuite, nous ajoutons 200μl de la solution tampon AL. L’ensemble est incubé à 700C pendant 10mn. Cette étape est celle de la lyse membranaire et permet la libération de l’ADN. Après l’incubation, nous ajoutons 200 μl d’éthanol (96-100%) dans chaque tube, ensuite nous les mélangeons au vortex et enfin nous les centrifugeons brièvement. Cette étape permet de faire la précipitation de l’ADN par l’alcool. Le contenu des tubes est ensuite déposé à l’aide d’une pipette de 1000 ml dans un tube avec colonne QIAamp préalablement numéroté en évitant de toucher les bords. Les tubes sont centrifugés à 8.000 tours par minute (t/mn) pendant 1 minute. Cette étape permet la fixation de l’ADN au niveau de la colonne de silice. La colonne est placée dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, celui contenant le filtrat est jeté. Nous ajoutons 500 μl du tampon AW1 en évitant de toucher les bords, suivi d’une centrifugation à 8.000 t/mn pendant 1 minute. La colonne QIAamp est placée dans un Plate 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI CQ B RPMI 750 375 187,5 93,75 46,875 23,438 11,719 5,8594 2,9297 0 RPMI CQ C RPMI 750 375 187,5 93,75 46,875 23,438 11,719 5,8594 2,9297 0 RPMI P Q D RPMI 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 3,9063 1,9531 0 RPMI P Q E RPMI 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 3,9063 1,9531 0 RPMI AMD F RPMI 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,7813 0,3906 0 RPMI AMD G RPMI 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,7813 0,3906 0 RPMI H RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI Kill Plate 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI LUM B RPMI 2000 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 0 RPMI LUM C RPMI 2000 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 0 RPMI MFQ D RPMI 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 3,9063 1,9531 0 RPMI MFQ E RPMI 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,8125 3,9063 1,9531 0 RPMI QN F RPMI 1500 750 375 187,5 93,75 46,875 23,438 11,719 5,8594 0 RPMI QN G RPMI 1500 750 375 187,5 93,75 46,875 23,438 11,719 5,8594 0 RPMI H RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI RPMI Kill Final Syber Green Drug (nM) Final Syber Green Drug (nM) f nouveau tube collecteur de 2 ml, le tube contenant le filtrat est jeté. Nous y ajoutons 500 μl de tampon AW2, ensuite nous centrifugeons les tubes à 14.000 t/mn pendant 3 minutes. Cette étape est celle du lavage. La dernière étape, celle de l’élution (avec deux élutions E1 et E2), consiste à placer la colonne dans un nouveau tube de 2 ml et d’y ajouter 50 μl du tampon AE. Les tubes sont ensuite incubés à la température ambiante pendant 3 minutes avant d’être centrifuger à 8.000 t/mn pendant 1 minute. La première élution (E1) est plus concentrée en ADN que la deuxième. Le filtrat obtenu contenant de l’ADN est conservé au congélateur à – 20°C pour une utilisation ultérieure.