Isolement et identification de Porphyromonas gingivalis 

Isolement et identification de Porphyromonas gingivalis 

Prélèvements

Pour la réalisation de cette étude, des échantillons sous-gingivaux ont été prélevés chez des patients reçus en consultation dans le service de parodontologie du centre hospitalouniversitaire de Beni Messous d’Alger. Les sujets sont atteints de parodontite agressive présentant des poches parodontales profondes, dont le site est de plus de 7 mm de profondeur au cour du sondage. Le saignement lors du sondage et la perte osseuse radiographique faisaient aussi partie des critères de sélection. Les patients inclus, sont des personnes des deux sexes, âgés entre 18 et 35 ans, ne souffrant pas de maladies systémiques, et qui ne devaient pas avoir fait l’objet d’un traitement parodontal quelconque ou d’une antibiothérapie pour infection d’origine dentaire, au cours des six derniers mois. Ce délai minimise leur impact sur la progression de la maladie. Les prélèvements doivent être effectués au moins deux heures après toute prise d’aliments, de boisson ou de brossage des dents. Au moment de la collecte, la plaque supra-gingivale est soigneusement retirée à l’aide d’une curette, de compresses et de sérum physiologique stériles, afin d’éviter la contamination de l’échantillon sous gingival. Après nettoyage, les sites choisis sont isolés de la salive par des rouleaux de coton salivaire puis séchés à l’air. Deux pointes de papier stérile sont introduites dans la poche pour récolter la plaque sous gingivale parodontale. Après 20 à 30 secondes, les pointes sont retirées et sont immédiatement transférées dans un tube de transport pour l’analyse microbiologique. Celle-ci a été réalisée au niveau du laboratoire des anaérobies et du botulisme de l’institut Pasteur d’Algérie (I. P. A).

Transport des échantillons

Les prélèvements sont transportés dans du milieu Amies semi-gélosé dont la composition permet de maintenir la vitalité des bactéries anaérobies strictes. Ce milieu permet également de conserver les anaérobies pendant 24 à 48 heures. Afin d’éviter les modifications qualificatives et quantitatives de la population sous-gingivale, les échantillons doivent être traités dans un délai de 48 heures après le prélèvement.

Isolement et purification de Porphyromonas gingivalis

L’isolement est conduit sur gélose au sang enrichie en hémine (10 μg/ml) et en ménadione (1 µg/ml). Il est réalisé par un simple ensemencement en surface à l’aide de stries transversales. L’incubation est conduite à 37°C pendant 5 jours en atmosphère anaérobie (10% H2, 10% CO2, 80%N2) en déposant les boites à l’intérieur d’une jarre model «BD Gas PakTM EZ, Becton, Dickinson and Company , USA» en présence de générateurs de gaz «Gas PakTM EZ, Becton, Dickinson and Company , USA». Les colonies présentant une morphologie et une pigmentation caractéristique sont soigneusement prélevées et repiquées de nouveau et séparément sur le milieu de culture sélectif. Ainsi plusieurs repiquages sont réalisés. Afin de s’acquérir de la pureté de la culture des observations microscopiques après coloration de Gram ont été réalisées.

Pré-identification de Porphyromonas gingivalis

Les différents tests de la pré-identification sont les suivants:  Coloration de Gram C’est une coloration différentielle qui divise les bactéries en deux classes : Gram + et Gram -. Elle est basée sur la composition différentielle de la paroi en lipides qui sont élevés (20%) chez les Gram- et faibles chez les Gram +.  Recherche de la catalase La catalase est une enzyme qui a la propriété de décomposer l’eau oxygénée (peroxyde d’hydrogène).  Recherche de l’oxydase Le cytochrome oxydase ou oxydase est une enzyme de la chaîne respiratoire bactérienne qui catalyse des réactions d’oxydation.

L’identification biochimique (Galerie API 20 A)

L’identification est effectuée en tenant compte des critères morphologiques des colonies obtenues sur le milieu de culture ainsi que la morphologie cellulaire (observation sous microscope). Seules les souches dont l’aspect macroscopique et microscopique est caractéristique, ainsi dépourvues de catalase et d’oxydase seront retenues.L’identification de cette espèce est facilitée par l’utilisation d’une galerie biochimique API 20A (BioMérieux, France). La galerie API 20 A est un système standardisé associant 20 tests biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant. Figure 9. Galerie biochimique API 20A (BioMérieux, France).

Etude de la sensibilité de P. gingivalis aux antibiotiques

L’antibiogramme est réalisé sur gélose Columbia au sang laqué enrichie en ménadione selon la technique de diffusion sur milieu solide. A partir d’une culture pure sur milieu d’isolement, une suspension bactérienne a été préparée dans du milieu BHI réduit et supplémenté d’hémine (10 μg/ml) et de ménadione (1 μg/ml) (BHIB-HK). La suspension est bien homogénéisée et dont l’opacité est ajustée au standard Mc Farland 1 (108 UFC/ml). L’ensemencement est soigneusement réalisé à l’aide d’un écouvillon stérile de manière à obtenir une croissance bactérienne uniforme. Les disques d’antibiotiques à tester (Tableau 1) sont ainsi appliqués sur la surface de la gélose, ces derniers doivent être espacés de 24 mm, centre à centre. Ensuite les boites de pétri sont incubées pendant 48 heures à 37 °C en atmosphère anaérobie.