Ingénierie moléculaire de surfaces bi-fonctionnelles pour des applications de biodétection sans marquage basée sur la diffraction

Processus de biodétection

L’idée générale est d’utiliser l’affinité moléculaire entre deux biomolécules : les molécules cibles, que l’on souhaite détecter et les molécules sondes. Cette affinité particulière entre ces molécules est spécifique et les molécules interagissent entre elles de manière non covalente lorsqu’elles sont mises en présence pour former des complexes cibles/sondes . Cette affinité moléculaire peut être traduite par un paramètre thermodynamique défini à partir de la constante d’équilibre association/dissociation de la réaction. Lors d’une analyse moléculaire, on cherche à détecter l’interaction entre les molécules sondes, immobilisées à la surface du biocapteur ou de la biopuce, et les molécules cibles ou biomarqueurs présents dans un prélèvement ou une solution. La technique de détection choisie permet ensuite de traduire cette interaction en un signal ou une information interprétable pour l’utilisateur.
Un processus de biodétection englobe donc trois étapes : immobilisation de molécules sondes sur une surface, interaction avec les molécules cibles en solution, détection et traduction de l’information biologique en signal physique quantitatif.
Lorsque ces étapes sont réunies autour d’un même outillage, on parle alors de plateforme d’analyse de biodétection.

Fabrication d’un substrat moléculaire

La réalisation des supports sur lesquels seront basées les analyses moléculaires est la 1ere étape d’un processus de biodétection. Ces substrats peuvent aussi être appelés biopuces ou puces. Ce terme désigne au sens large une surface sur laquelle des molécules sondes ou ligands sont immobilisés.
Elles sont choisies en fonction de l’espèce moléculaire à détecter ou à analyser. Il existe plusieurs catégories dont les plus représentatives sont les puces à protéines, les puces à ADN et les puces à cellules. Nous verrons par la suite les caractéristiques de chacune de ces puces. Les molécules d’intérêt sont ensuite immobilisées sur un support. Pour cela, plusieurs techniques de fabrication existent et nous détaillerons les principales dans le paragraphe suivant. L’avantage de ce format biopuce (ou microarray) porte sur l’utilisation d’un support solide sur lequel des molécules sondes sont déposées de manière ordonnée afin de les immobiliser chimiquement.
Les critères de choix des molécules sondes dépendent : Critères de choix : de leur sélectivité par rapport à l’espèce à détecter ou de l’objectif de la puce, de leur coût, car la rareté du matériel biologique peut être un frein au développement commercial d’une biopuce et restreindre son usage en laboratoire si le coût de la puce s’avère trop élevé.
Le choix d’une technique d’immobilisation dépend : du multiplexage souhaité de la puce. Ce terme désigne le nombre d’entités biochimiques différentes que l’on souhaite immobiliser sur la surface. Cette notion permet d’effectuer plusieurs dizaines de tests simultanément sur une même surface. Pour certaines applications comme le criblage pharmaceutique, il est nécessaire de fabriquer des puces à haut débit, c’est-à-dire possédant un grande nombre de molécules par unité de surface. La technique d’immobilisation doit donc permettre d’atteindre ce challenge technologique.de la résolution des motifs. Les molécules sont déposées de façon organisée sur la surface afin de faciliter la lecture des analyses. Les motifs délimités sont généralement de dimension micrométrique (entre 50-150 µm). Dans la course à la miniaturisation, les biopuces ne sont pas épargnées. Si la taille des motifs est diminuée, alors la densité d’une puce peut être augmentée et il sera possible de faire plus d’analyses simultanées.
de la dénaturation des molécules immobilisées. La fonctionnalité de certaines molécules, comme les protéines par exemple, est reliée à leur conformation tri-dimensionnelle. Elles sont donc très fragiles. La technique de dépôt choisie ne doit donc pas dénaturer les molécules manipulées.

Développement des biopuces

Les biopuces sont les supports des analyses moléculaires. De nombreuses techniques de fabrication de biopuces existent. Ces méthodes sont adaptées au type de puce souhaitée (puces à protéines, à ADN, à sucre, à cellules …) mais aussi à leur densité, qui correspond au nombre de tests que l’on peut effectuer simultanément. La densité d’une puce traduit le nombre de plots d’analyse où les sondes sont immobilisées sur la surface. On distingue des puces : de faible densité : entre 10 et 1000 zones d’analyse, généralement destinées au marché du diagnostic. de moyenne densité : entre 1000 et 10 000 zones d’analyse, généralement destinées au génotypage et à l’étude des mutations génétiques. de haute densité: supérieure à 10 000 zones d’analyse, généralement destinées au séquençage de gènes et au criblage pharmaceutique.

Développement des biocapteurs

Il existe plusieurs techniques de détection d’interactions biologiques. Comme nous l’avons vu dans l’introduction, ces techniques peuvent être avec ou sans marquage. A l’heure actuelle, les analyses de diagnostic et de criblage sont basées principalement sur des techniques de biodétection avec marquage, et en particulier sur la fluorescence. Ce marquage est coûteux et peut dénaturer les molécules marquées. Dans le cas d’un marquage avec des fluorophores, leur stabilité dans le temps est limitée à cause du photo-blanchiment. Bien que d’autres systèmes aient émergé ces dernières décennies, la détection par marquage reste la plus répandue. Les techniques de biodétection sans marquage sont pourtant nombreuses (potentiométrique, ampérométrique, capacitive, thermique, optique, acoustique, mécanique) 54 et varient de par leur état de développement (en laboratoire ou commercialisé). Nous verrons au cours de ce chapitre, quelques unes des principales techniques de lecture avec et sans marquage commercialisées, c’est-à-dire présentes sur le marché de la détection d’interactions biologiques.

Réalisation de moules en silicium

Objectifs : Dans ce travail de thèse, les dépôts que l’on souhaite réaliser sont des réseaux de diffraction, composés de lignes moléculaires de périodicité submicrométrique (généralement de 500 nm de largeur avec une périodicité de 1 µm). Les moules en silicium, utilisés dans le procédé de dépôt doivent donc posséder la même topographie de surface . Une lame de microscope classique a une dimension de 76 x 26 mm. Nous souhaitons déposer des réseaux moléculaires sur une zone de 60 x 20 mm sur cette lame. Cet arrangement ordonné de réseaux est appelé matrice. Si nous fixons la périodicité de ces matrices à 2.25 mm, nous pouvons alors déposer une matrice de 25 colonnes et 12 lignes de réseaux sur une lame de microscope. Les timbres en PDMS utilisés pour déposer ces réseaux par µCP doivent donc posséder cette topographie particulière, tout comme les moules en silicium sur lesquels ils sont moulés.
Cette volonté de posséder une forte densité de structures à l’échelle nanométrique sur une large surface en silicium, reste un challenge technologique. Afin de réaliser plusieurs matrices sur un même moule en silicium, un wafer 6 pouces est privilégié.

Lithographie optique par contact ou en proximité

La lithographie optique par contact ou en proximité, communément appelée photolithographie a été principalement développée pour répondre aux besoins de la microélectronique, et reste encore aujourd’hui utilisée pour la plupart des procédés industriels. Elle consiste à insoler par un rayonnement lumineux dans l’UV, une plaquette de silicium préalablement enduite d’une résine photosensible, au travers d’un masque comportant des zones transparentes et opaques. L’insolation au travers de ce masque va permettre de modifier chimiquement certaines zones de la résine selon les motifs présents sur le masque (en fonction de la polarité de cette dernière, les zones ayant reçu un rayonnement lumineux sont soit fragilisées soit durcies). Les structures sont ensuite révélées par un développement en phase liquide qui dissout la couche de résine sélectivement . Dans le cas des résines, dites positives, la partie insolée qui est fragilisée est dissoute dans le révélateur. L’image latente laisse place à l’image concrète du motif. Inversement pour les résines négatives, les parties non insolées vont être dissoutes. Les motifs présents sur le masque vont donc apparaitre sur la plaquette de silicium qui pourra par la suite être attaquée en profondeur, chimiquement ou physiquement par des techniques de gravure comme par exemple la RIE, Reactive Ion Etching. Durant cette étape, les zones non protégées par la résine sont gravées. Nous obtenons donc une plaquette en silicium comportant des structures ou motifs en relief à l’échelle micrométrique répondant à nos besoins de structuration de la matière. Le terme de contact ou proximité provient en fait de l’éloignement du masque par rapport au wafer enduit de résine. Certains procédés peuvent s’effectuer avec le masque légèrement éloigné du wafer, pour le protéger de la résine qui recouvre le wafer. Ce léger éloignement entraîne cependant une perte dans la résolution des motifs en raison du phénomène de diffraction.
La lithographie optique en contact ou en proximité est une technique de fabrication parallèle, c’est-à-dire qu’il est possible de réaliser simultanément plusieurs structures sur une plaquette de silicium. Cette technique est relativement simple et surtout rapide.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : DIAGNOSTIC MOLECULAIRE : DE LA FABRICATION DE BIOPUCES AUX ANALYSES IN-VITRO
I/ DEROULEMENT D’UNE ANALYSE DE BIODETECTION
1. PROCESSUS DE BIODETECTION
a. Fabrication d’un substrat moléculaire
b. Analyse biologique
c. Lecture de l’échantillon
2. DOMAINES D’APPLICATIONS
II/ DEVELOPPEMENT DES BIOPUCES
1. TECHNIQUES DE FABRICATION
a. Photolithographie
b. Jet d’encre
c. Dépôt par aiguilles
d. Lithographie douce
2. LES DIFFERENTES PUCES
a. Puces à ADN
b. Puces à protéines
c. Puces à peptides
d. Puces à sucre
e. Puces à cellules
3. PROBLEMATIQUE
III/ DEVELOPPEMENT DES BIOCAPTEURS 
1. TECHNIQUES DE BIODETECTION AVEC MARQUAGE COMMERCIALISEES
a. Tests immunologiques
b. Lab-on-chip
2. TECHNIQUES DE BIODETECTION SANS MARQUAGE COMMERCIALISEES
a. Biodétection mécanique : la micro balance à quartz (QCM)
b. Biodétection optique
i. SPR
ii. Interférométrie
iii. Interférométrie sur des surfaces nano poreuses
iv. Diffraction d’un réseau moléculaire
3. PROBLEMATIQUE
IV/ CAHIER DES CHARGES D’UNE PLATEFORME DE BIODETECTION : DEFINITION DU CADRE DE LA THESE
REFERENCES 
CHAPITRE 2 : NANO FABRICATION DE RESEAUX MOLECULAIRES
I/ REALISATION DE MOULES EN SILICIUM 
1. OBJECTIFS
2. PROCEDE DE LITHOGRAPHIE
II/ TECHNIQUES DE LITHOGRAPHIE 
1. LITHOGRAPHIE OPTIQUE PAR CONTACT OU EN PROXIMITE
2. LITHOGRAPHIE OPTIQUE EN PROJECTION
3. LITHOGRAPHIE ELECTRONIQUE
4. COMPARAISON
III/ FABRICATION DE MATRICES DE RESEAUX PERIODIQUES PAR LITHOGRAPHIE OPTIQUE PAR PROJECTION 
1. PROCEDE MIS EN PLACE
2. STRUCTURES OBTENUES : CARACTERISATION DU MOULE
3. STRUCTURES OBTENUES : CARACTERISATION D’UN TIMBRE
IV/ DUPLICATION DES MOULES
V/ AUTOMATISATION DES DEPOTS PAR µCP
1. L’APPAREIL DE DEPOT PAR µCP SEMI-AUTOMATISE
2. VARIABILITE ENTRE MOTIFS D’UNE MEME IMPRESSION
3. VARIABILITE ENTRE PLUSIEURS IMPRESSIONS
4. ETUDE COMPARATIVE AVEC UN ROBOT A AIGUILLES
VI/ MULTIPLEXAGE DES DEPOTS 
1. DOUBLE DEPOT DE MOLECULES EN UNE SEULE IMPRESSION
2. UN TIMBRE EN PDMS PERMETTANT LE MULTIPLEXAGE : LE MACROTIMBRE
VI/ CONCLUSIONS 
REFERENCES 
CHAPITRE 3 : REALISATION DE MOTIFS BIOMOLECULAIRES MINIMISANT L’ADSORPTION NON-SPECIFIQUE
I/ LIMITATION DE L’ADSORPTION NON-SPECIFIQUE SUR UN SUBSTRAT 
1. ENJEUX
2. ETAT DE L’ART SUR LA REALISATION DE BIOPUCES A PROTEINES MINIMISANT L’ADSORPTION NON SPECIFIQUE
a. Blocage de surface
b. Utilisation de polymères
c. Immobilisation de molécules sur des couches de polymères
d. Traitement du timbre en PDMS pour l’impression moléculaire
II/ BI-FONCTIONNALISATION DE SURFACES
1. BLOCAGE DE SURFACE A L’ETHANOLAMINE
2. PASSIVATION DE SURFACE BASEE SUR DES POLYMERES
a. Le PLL-g-PEG
i. Impression moléculaire de motifs micrométriques de PLL-g-PEG
ii. Etude des interactions non-spécifiques par fluorescence
b. Le PLL-g-Dextran
i. Impression moléculaire de motifs micrométriques de PLL-g-dextran
ii. Etude des interactions non-spécifiques par fluorescence et AFM
iii. Propriétés anti-adhésives du PLL-g-dextran étudiées par QCM
iv. Influence de l’énergie de surface du timbre en PDMS
3. IMPRESSION DE MOLECULES SONDES SUR UNE COUCHE PASSIVANTE
a. Impression moléculaire sur des couches passivantes de PEO
i. Dépôt et maintien des molécules sondes sur une couche de passivant
ii. Hypothèse formulée
b. Impression de molécules sondes sur des couches passivantes de PLL-g-dextran
i. Fabrication d’une surface bi-fonctionnelle basée sur une couche de PLL-g-dextran
ii. Etude du comportement de la surface bi-fonctionnelle dans le cas d’une interaction non-spécifique
iii. Etude du comportement de la surface bi-fonctionnelle dans le cas d’une interaction spécifique
4. COMPARAISON DES TECHNIQUES MISES EN PLACE LORS D’UN PROTOCOLE COMPLET DE BIODETECTION
III/ BI-FONCTIONNALISATION DE SUBSTRATS TRIDIMENSIONNELS 
1. OBJECTIF
2. OBJET D’ETUDE : UN RESEAU PERIODIQUE DE LIGNES NANOMETRIQUES
3. ETUDE AFM
a. Fonctionnalisation du réseau avec les molécules sondes
b. Passivation du réseau
4. CARACTERISATION DES RESEAUX PERIODIQUES
a. Etude de rugosité de surface
b. Etude de l’intensité de diffraction
IV/ CONCLUSIONS 
REFERENCES 
CHAPITRE 4 : ETUDE DE LA FONCTIONNALITE DE BIOMOLECULES DEPOSEES PAR IMPRESSION : LE CAS DES ENZYMES
I/ STRUCTURATION DES ECHANTILLONS
1. REACTION ENZYMATIQUE BASEE SUR LA DEXTRAN- SACCHARASE
2. MICROCONTACT PRINTING DE PLL-G-DEXTRAN AVEC UN TIMBRE PLAT
3. MICROCONTACT PRINTING DE MOTIFS DE DEXTRAN- SACCHARASE SUR LA COUCHE DE PLL-G-DEXTRA
4. OBJECTIF DE L’ETUDE
II/ TECHNIQUES DE CARACTERISATION 
1. AFM
2. SEEC
III/ RESULTATS
1. MICROCONTACT PRINTING DE MOTIFS DE DEXTRAN- SACCHARASE SUR LA COUCHE DE PLL-G-DEXTRAN
2. SUIVI DE LA REACTION ENZYMATIQUE PAR AFM
3. SUIVI DE LA REACTION ENZYMATIQUE PAR MICROSCOPIE SEEC
4. CONCLUSION
REFERENCES 
CHAPITRE 5 : BIODETECTION OPTIQUE SANS MARQUAGE BASEE SUR LA DIFFRACTION
I/ LE PHENOMENE DE DIFFRACTION ET SON UTILISATION EN BIODETECTION 
1. INTRODUCTION
a. Diffraction par une fente
b. Diffraction à travers N fentes
2. DEVELOPPEMENT DE TECHNIQUES DE DETECTION BASEES SUR LA DIFFRACTION
a. Principe d’utilisation
b. Mise en place du système de détection
c. Application à la biodétection
i. Principe
ii. Détection multiple
iii. Interaction idéale – Interaction réelle
3. ETAT DE L’ART SUR L’UTILISATION DE LA DIFFRACTION
a. Biodétection
b. pHmètre
c. Multicouches lipidiques
d. Capteurs de gaz
4. CONTEXTE ET ENJEUX
II/ OUTILS DE LECTURE DEVELOPPES POUR CAPTER UNE INTENSITE DE DIFFRACTION 
1. PREUVE DE CONCEPT EN LABORATOIRE
a. Présentation du banc de mesure
b. Applications
2. TRANSFERT INDUSTRIEL DU CONCEPT VERS UN SCANNER AUTOMATISE
a. Chaîne de développement
b. Cahier des charges
c. Choix techniques
i. Description générale
ii. Système optique
iii. Degrés de liberté
iv. Traitement du signal
v. Influence du diamètre du faisceau laser
vi. Reproductibilité
vii. Récapitulatif
d. Applications
III/ VALIDATIONS EXPERIMENTALES
1. ETUDE DES PARAMETRES INFLUANT SUR L’INTENSITE DIFFRACTEE
a. Influence de la concentration de la solution d’encrage
b. Influence des lavages
c. Influence de la chimie de surface
2. BIODETECTION D’INTERACTIONS PROTEINES/PROTEINES
3. BIODETECTION D’INTERACTIONS ADN/ADN
a. Concept de fabrication
b. Fabrication de biopuce diffractante
c. Détection d’une hybridation simulée
d. Détection d’une hybridation réelle
IV/ REFLEXION SUR LA BIODETECTION PAR DIFFRACTION
1. AMELIORATION DU TRAITEMENT DES IMAGES
2. FABRICATION DES RESEAUX
3. AMELIORATION DES CONDITIONS D’INTERACTION
4. INFLUENCE DE LA CHIMIE DE SURFACE ET DE LA PASSIVATION
5. CONCLUSIONS
REFERENCES 
CONCLUSION
ANNEXE 1 : PROCEDE DE NETTOYAGE D’UN TIMBRE EN PDMS
ANNEXE 2 : ETUDE PAR QCM DE L’ADSORPTION D’ANTICORPS ANTI-GST SUR UNE COUCHE DE PLL-G-DEXTRAN DEPOSEE PAR µCP
ANNEXE 3 : FIXATION DE PROTEINES SUR LA RESINE SU8

Télécharger le rapport complet