EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT

EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT

Pour chaque plante étudiée, le mode de préparation de l’extrait brut consiste à macérer le matériel végétal dans l’éthanol 95° pendant 48 heures. L’évaporation du solvant d’extraction sous pression réduite fournit un extrait brut éthanolique. L’isolement des produits met en œuvre plusieurs techniques de fractionnement et de purification, à savoir le partage liquide-liquide avec des solvants non miscibles entre eux, la chromatographie sur colonne ouverte, la chromatographie flash, la chromatographie circulaire, la cristallisation dans des solvants adéquats, la chromatographie sur couche mince préparative et la chromatographie liquide haute performance (CLHP) à l’échelle semi-préparative. Les techniques chromatographiques utilisent diverses phases stationnaires, notamment la silice, la silice greffée par le groupement n-octadécyle (C18) et le gel de Sephadex LH-20, et différentes phases mobiles constituées par des mélanges binaires de solvants organiques ou de méthanol et d’eau. En ce qui concerne la CLHP, la phase stationnaire employée est la silice greffée en C18 et la phase mobile est généralement formée par un mélange de méthanol et d’eau. 13 III. TESTS BIOLOGIQUES Dans le cadre de la préparation de ce Mémoire de HDR, les principales activités biologiques recherchées sont : antiplasmodiale, antimicrobienne, anti-anaphylactique et anticancéreuse. III.1. Test d’activité antiplasmodiale Sauf indication contraire, le test d’activité antiplasmodiale a été réalisé in vitro au CNARP sur la souche chloroquino-résistante FCM29 de Plasmodium falciparum en utilisant la méthode fluorimétrique au SYBR Green I. SYBR Green I (Figure 1) est un réactif des acides désoxyribonucléiques (ADN) en biologie moléculaire. Le complexe ADN-réactif formé émet une intense fluorescence entre 505 et 615 nm à la suite d’une excitation par un rayonnement dans le domaine du visible entre 390 et 505 nm. En se fixant sur l’ADN du Plasmodium, l’utilisation du SYBR Green I permet de suivre quantitativement la croissance du parasite lors du test d’activité antiplasmodiale in vitro. Les globules rouges humains sains indispensables à la croissance du Plasmodium étant dépourvus d’ADN, ils ne contribuent point à la fluorescence du milieu après addition du réactif. Les résultats sont exprimés en concentration médiane inhibitrice (CI50). Celle-ci correspond à la concentration d’extrait (ou fraction ou produit pur) qui inhibe la croissance de la moitié (50%) de la population parasitaire en culture après 72 heures d’incubation. Figure 1 : Structure chimique du SYBR Green I 

Test d’activité antimicrobienne

L’activité antimicrobienne a été évaluée par la méthode de diffusion sur disques. Des disques de cellulose de 6 mm de diamètre, imbibés de l’échantillon à tester sont séchés à l’air libre, puis disposés stérilement en boîte de Pétri à la surface du milieu de MuellerHinton pour les bactéries Staphylococcus aureus (ATCC 11632) et Klebsiella pneumoniae (culture du CNARP), et de Sabouraud pour la levure Candida albicans (ATCC 10231), préalablement ensemencée avec le germe-test. L’apparition d’une zone d’inhibition circulaire autour du disque après 24 heures à 37°C indique que l’échantillon est actif contre le germe-test. Les tests sont réalisés en trois exemplaires en présence de témoins positifs, la tétracycline pour le test antibactérien et le miconazole pour l’essai antifongique. Pour le bioguidage des travaux chimiques, la méthode bioautographique sur CCM a été utilisée. III.3. Test d’activité anti-anaphylactique L’anaphylaxie est l’augmentation de la sensibilité de l’organisme à une substance étrangère (antigène) après que celle-ci y a été introduite. In vivo, l’animal sensibilisé réagit par une broncho-constriction. L’effet contracturant de l’antigène (réaction anaphylactique) peut être retrouvée, in vitro, sur un organe isolé prélevé sur un animal sensibilisé. Le test d’activité anti-anaphylactique a été réalisé sur la trachée isolée de cobaye. La contraction d’origine immunologique est obtenue avec une solution saline d’ovalbumine. L’extrait (ou fraction) possède une activité anti-anaphylactique quand il (ou elle) prévient la contraction d’origine immunologique de l’organe. III.4. Test de cytotoxicité Sauf indication contraire, l’évaluation de l’activité cytotoxique a été effectuée à Virginia Polytechnic Institute and State University (VPISU) sur la lignée de cellules cancéreuses A2780 de l’ovaire humain en utilisant le réactif au bleu Alamar. Le bleu Alamar est un réactif qui peut adopter deux formes : la forme oxydée de couleur bleue ou résazurine et la forme réduite de couleur rougeâtre qui est un fluorophore ou résorufine (Figure 2). La possibilité de réduction du bleu Alamar par les cellules vivantes 15 est mise à profit pour déterminer la viabilité des cellules après un traitement par une substance cytotoxique. La mesure de la fluorescence s’effectue en excitant la résorufine à 530 – 560 nm et déterminant l’émission à 590 nm. Les résultats sont exprimés en concentration médiane inhibitrice (CI50). Le témoin positif est constitué par le paclitaxel (CI50 = 0,028µM). Résazurine Résorufine Figure 2: Structures chimiques de la résazurine et la résorufine

DETERMINATION STRUCTURALE

Les structures chimiques présentées dans les différents chapitres qui suivent ont été établies en employant des méthodes physiques et chimiques. Les démarches suivies pour l’identification structurale des produits, notamment lorsqu’il s’agit de produits nouveaux, sont exposées dans les publications correspondantes dans le volume II de ce Mémoire. Elles sont reprises succinctement pour les produits nouveaux figurant dans le troisième chapitre du présent volume. Ces méthodes d’dentification structurale comprennent notamment la détermination des constantes physiques, les analyses spectroscopiques et la comparaison avec les données de la littérature.

Détermination des constantes physiques

Il s’agit de déterminer les constantes telles que le point de fusion et le pouvoir rotatoire des produits.

Analyses spectroscopiques

– La spectrométrie de masse (SM) où les modes d’ionisation « Fast Atom Bombardment (FAB) » et « Electrospray-ionization (ESI) » ont été employés à haute 16 résolution. La technique « Spectrométrie de Masse/Spectrométrie de Masse » ou « Tandem Mass Spectroscopy » a été mise à profit pour obtenir le spectre de masse d’un ion particulier, résultant de la fragmentation d’un produit lors de son analyse en ESI-FAB. – La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire monodimensionnelle (RMN du 1H et du 13C) ainsi que les expériences en RMN du 13C utilisant les séquences d’acquisition « Attached Proton Test ( 13C-APT)» et « Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ( 13C-DEPT)». Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm. – La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire bidimensionnelle (RMN 2D) employant principalement les techniques « Homonuclear Shift-Correlated Spectroscopy (COSY 1H1H) », « Total Correlation Spectroscopy (TOCSY) », « Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) », « Heteronuclear Multiple-Bond Correlation (HMBC) » et « Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY) ». – Les spectroscopies d’absorption dans l’Ultra-violet et le Visible (UV/Vis) et dans l’Infrarouge (IR). IV.3. Comparaison avec les données de la littérature Dans de nombreux cas, la comparaison des données spectrales obtenues avec celles publiées dans la littérature pour le produit en question ou les substances de structures chimiques analogues est d’une grande utilité pour établir définitivement la structure chimique. Vu le nombre important de produits connus isolés, les bibliographies qui indiquent les données spectrales ayant servi de références pour leur identification structurale se trouvent dans les publications correspondantes dans le volume II de ce Mémoire et ne sont pas reprises dans le présent volume.