Evaluation de l’impact des Dam et Dcm méthylases

Evaluation de l’impact des Dam et Dcm méthylases

Cependant quel que soit le milieu de culture, le profil de fluorescence est le même entre les souches parentale d’E. coli et les souches mutées sur une des deux méthylases. La limite de ce modèle est qu’il s’agit d’un système hétérologue et bien qu’il y ait des ressemblances entre les deux bactéries (forme active de PhoP est la forme phosphorylée, activation à bas MgSO4), il y a aussi des différences comme l’absence de PmrAB et PmrD chez Photorhabdus alors qu’ils sont présents chez E. coli. Enfin par EMSA nous avons pu montrer une fixation directe de PhoP (Salmonella) sur la région promotrice de pbgPE (Photorhabdus) pour des concentrations en PhoP-P de 1 µM. Ceci pourrait expliquer pourquoi pbgPE a pu être activé par le TCS PhoPQ d’E. coli dans les systèmes hétérologues.

Il est possible que la région promotrice de pbgPE chez Photorhabdus soit plus « dégénérée » dans le sens ou elle accepte la fixation de protéines PhoP hétérologues. Cela pourrait également expliquer l’absence de PhoP box en amont de pbgPE (Article 2). Donc pour pouvoir conclure sur les méthylations, nous avons testé chacune des deux méthylations indépendamment chez Photorhabdus. Tout d’abord nous avons testé si le site GATC était méthylé. Pour cela nous avons digéré l’ADN génomique extrait des souches TT01 et TT01 cultivée en présence de polymyxine B, ainsi que l’ADN plasmidique TT01/PpbgPE-gfp[AAV] (plasmide qui a été décrit et utilisé au lecteur de fluorescence en microplaque et en cytométrie) de ces mêmes souches. Les ADNs ont été digérés par Sau3A, DpnI et EcoRI. Sau3A clive les sites GATC et est insensible à la méthylation, DpnI ne digère l’ADN que si celui ci est méthylé sur l’adénine du site GATC, enfin EcoRI est utilisé ici comme enzyme contrôle et ne clive pas les sites GATC. Ces ADN ont ensuite été utilisés pour réaliser un Southern Blot grâce à une sonde correspondant à la région promotrice et une partie du gène de pbgPE (229 pb en tout) marquée à la digoxygénine. Le profil de digestion (figure 36) entre la condition avec et sans polymyxine B est exactement le même donc le profil de méthylation du site GATC par la Dam méthylase n’est pas différentiel et ne permet pas d’expliquer le switch. Afin de confirmer ce résultat, nous avons muté le site GATC en GTTC dans la région promotrice de l’opéron pbgPE. Ces mutations ont été réalisées sur les plasmides utilisés pour la cytométrie, c’est à dire que la région promotrice mutée de pbgPE est en fusion transcritpionnelle avec la GFP déstabilisée. Ces plasmides ont été conjugués dans TT01 et observés en microscopie à fluorescence et on a pu constater qu’on avait moins de 1% de bactéries fluorescentes ce qui correspond aux valeurs obtenues avec la même construction non mutée.

Ainsi, on a pu confirmer que la Dam méthylation n’était pas à l’origine du switch chez Photorhabdus. Nous avons ensuite testé l’effet des Dcm méthylases. Pour regarder le profil de méthylation des cytosines de la région promotrice de pbgPE, nous avons utilisé une méthode largement employée chez les eucaryotes: le traitement des ADNs au bisulfite. En effet, le bisulfite transforme les cytosines non méthylées en uracile et après amplification par PCR une thymine viendra remplacer les cytosines.mutées) et chez TT01. L’introduction des constructions PpbgPE-gfp[AAV] chez les souches d’E. coli dam- /dcm- vs dam+/dcm+ ont montré un rôle probable des méthylations Dam et/ou Dcm dans l’apparition de l’hétérogénéité (augmentation de l’expression du promoteur de pbgPE dans les doubles mutants). En revanche, aucun des simples mutants dam/dcm chez E. coli n’a donné de résultats. De plus, on a pu démontrer chez TT01, que les sites reconnus par les Dcm et Dam méthylases de la région promotrice de pbgPE étaient méthylé dans les deux sous-populations. Cependant, l’hypothèse d’une méthylation comme responsable du switch épigénétique n’est toujours pas exclue à l’heure actuelle. En effet, Chez Salmonella, l’hypothèse qu’un produit de PhoP puisse aussi modifier le profil de méthylation a été émise. Dans cette optique deux approches sont poursuivies au laboratoire et seront mise en œuvre après mon départ. La première est une approche globale de RNAseq entre les deux sous-populations afin d’identifier le régulon PhoP dans sa globalité et notamment rechercher un lien entre l’expression de phoP et des DNA méthylases. La seconde est une approche globale du méthylome.

En effet, le laboratoire est en discussion avec Génome Québec afin qu’ils réalisent le méthylome de TT01 pour les deux sous-populations selon la technique de séquençage SMRT qui permet d’identifier les modifications spécifiques de chaque nucléotide lorsqu’elles sont présentes. Ces deux approches misent en parallèles pourraient confirmer ou réfuter l’hypothèse « méthylation » mais apporteraient, quoi qu’il en soit, de nouvelles données sur le régulon PhoP. Enfin, il faut savoir que les résultats obtenus chez E. coli doivent être traités avec précaution. En effet les méthylases Dam, Dcm et EcoK1 sont les principales méthylases identifiées dans le génome de E. coli. Or chez Photorhabdus, on ne retrouve pas moins de 12 méthylases dont la moitié sont des méthylases orphelines (n’appartenant pas à un système de restriction-méthylation). Parmi ces méthylases orphelines, on retrouve par exemple un homologue de la Dam méthylase. Chez Photorhabdus, très peu de profils de méthylation ont pu être attribués à une méthylase précise, donc cela rend l’analyse plus difficile des régions promotrices. L’approche globale du méthylome pourrait permettre d’identifier de nouveaux sites de méthylations non définis à l’heure actuelle et la méthylase responsable de l’hétérogénéité n’a pas encore été décrite à ce jour. Cette thèse a été résumée en un schéma afin de faire ressortir tous les éléments importants à se rappeler .