Détection de l’ammoniaque : test couplé à la glutamate déshydrogénase (GDH)

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Introduction

Le soufre (S), élément biochimique et géochimique important, joue un rôle primordial dans le vivant : non seulement c’est un constituant des acides aminés soufrés essentiels que sont la cystéine et la méthionine, composants structuraux des protéines, mais c’est aussi un élément très réactif qui permet de nombreuses et diverses fonctions enzymatiques grâce, en outre, à l’implication de la fonction thiol de la cystéine dans des triades catalytiques. Le soufre est par ailleurs présent dans de nombreux cofacteurs enzymatiques, que ce soit dans des substances organiques actives majeures comme le coenzyme A ou encore les vitamines B1 (la thiamine ou aneurine) et B8 (la biotine ou vitamine H ou encore coenzyme R), ou bien au sein de protéines sous forme inorganique Si dans des clusters Fe-S permettant le transport d’électrons (cas des ferredoxines). Les molécules soufrées participent également à l’homéostasie redox grâce à leur rôle anti-oxydant lors des stress oxydatifs. Enfin, la méthionine, en plus d’être un acide aminé protéinogène, est aussi un composant clef du métabolisme via la synthèse de la S-adénosylméthionine (SAM), principal transporteur de groupement méthyle dans les cellules. La diversité des processus métaboliques microbiens liés au soufre (réduction des sulfates, dismutation, oxydation des sulfures) et celle des différentes familles de molécules soufrées participent ainsi plus globalement à l’équilibre et à la stabilité du cycle biogéochimique du soufre, et ce notamment dans les écosystèmes marins. Par exemple, le diméthylsulfoniopropanoate (DMSP), principalement produit par les algues et les plantes, est l’un des principaux composés soufrés présent dans l’environnement et joue un rôle écologique majeur. Outre son rôle dans la chaine trophique des bactéries marines et du sol capables d’assimiler le DMSP comme source de soufre, le catabolisme du DMSP engendre le sulfure de diméthyle (DMS), molécule volatile impliquée dans la régulation du climat et la formation des nuages.
De nombreux microorganismes peuvent utiliser le sulfate inorganique, source abondante de soufre facilement assimilable et disponible dans la biosphère aérobie, et les sulfonates, très répandus également dans la nature. Ces composés sont incorporés via différents transporteurs et transformés en sulfure d’hydrogène (H2S) pour conduire généralement à la biosynthèse de la L-cystéine. En revanche, comme nous le verrons ultérieurement, les microorganismes utilisent en général les sulfonates uniquement dans des conditions limitées en sulfate/soufre par le biais de régulations qui seront développées dans cette introduction.
Les molécules soufrées ont également un fort intérêt industriel, leur production se faisant souvent à grande échelle. Pour la synthèse de la L-méthionine, utilisée par exemple comme additif déterminant pour l’alimentation animale, de nombreux brevets existent pour des productions industrielles allant jusqu’à plusieurs centaines de tonnes par an (pour une revue, voir celle de Wilke T., 20141). Illustrant la dynamique de ces recherches, une série de brevets déposés en 2017 par l’entreprise Arkema permet d’améliorer le processus de production de cet acide aminé avec la mise au point d’une cascade multienzymatique produisant du méthanethiol2,3, utilisé comme précurseur de synthèse, et qui était précédemment produit par voie chimique. La synthèse de L-cystéine n’est pas en reste et présente également un fort intérêt pour les industries pharmaceutique, agroalimentaire et cosmétique. Dans l’introduction de ce manuscrit nous allons décrire les voies de biosynthèse connues de ces deux acides aminés soufrés protéinogènes, ainsi que leurs voies de recyclage. La littérature sur le sujet est extrêment abondante car les voies sont très variées selon les organismes. Il sera donc difficile d’être exhaustif malgré une revue bibliographique étendue.
Nous verrons également dans cette introduction pourquoi Acinetobacter baylyi ADP1 (ADP1), une bactérie du sol aux capacités de dégradation des molécules aromatiques remarquables, est utilisée au laboratoire comme organisme modèle pour l’élucidation de nouvelles fonctions enzymatiques et voies métaboliques. L’observation de phénotypes non prédits par l’annotation du génome d’ADP1 a abouti à l’initiation de l’étude du métabolisme du soufre avec deux axes : (1) l’étude de la biosynthèse de la L-méthionine (L-Met) et plus spécialement l’étude des familles d’enzymes non homologues MetX et MetA catalysant l’acylation de l’homosérine dans le monde vivant, première étape de cette voie ;
(2) l’exploration des voies de recyclage de la L-méthionine chez ADP1, ainsi que les voies d’assimilation de certaines molécules soufrées. Les deux objectifs suivis tout au long de cette thèse ont donc été d’une part de redéfinir le rôle exact d’enzymes appartenant à la famille MetX effectuant l’acylation de la sérine et non de l’homosérine, et d’autre part de tenter d’élucider les voies métaboliques permettant à ADP1 de métaboliser la méthionine afin de s’en servir comme source de soufre.

Voies de biosynthèse de la L-cystéine

Sulfhydrylation

Activation de la L-sérine

Chez les bactéries et les plantes, la L-cystéine est le précurseur de la plupart des métabolites contenant du soufre, y compris la L-méthionine et le glutathion, molécule anti-oxydante. La voie de biosynthèse de la L-cystéine joue donc un rôle important dans l’incorporation du soufre inorganique dans les composés organiques.
La voie de biosynthèse de la cystéine à partir de la L-sérine est une conversion en deux étapes, via l’intermédiaire O-acétyl-L-sérine (OAS). La voie a été étudiée chez les bactéries4, les archées5 et les plantes6. La première étape consiste ainsi en l’acétylation de la L-sérine par une sérine O-acétyltransférase (SAT, EC 2.3.1.30). Les SAT sont majoritairement codées par les gènes cysE mais aussi par des gènes de type srpH (figure 1). Le premier représentant caractérisé de SrpH (Uniprot ID : Q59967) est codé par un gène plasmidique de Synechococcus elongatus7 et n’a aucune homogie de séquence avec sa SAT chromosomique (CysEelongatus, Uniprot ID : Q59967) ou CysEcoli (Uniprot ID :
P0A9D4). Ces deux isoenzymes appartiennent cependant à la même famille d’enzymes ayant le motif
hexapeptide (IPR001451) et partagent la même signature Interpro commune aux SAT (IPR005881). On retrouve par contre des homologues de SrpH chez des protistes parasites du genre Entamoeba8.
La seconde étape, la sulfhydrylation de l’OAS, permet l’incorporation du soufre contenu dans le sulfure d’hydrogène (H2S) et est catalysée par une enzyme dépendante du pyridoxal-phosphate (PLP) : il s’agit de la cystéine synthase (CS, EC 2.5.1.47), aussi appelée O-acétyl-L-sérine sulfhydrylase (OASS) ou encore O-acétylsérine(thiol)-lyase (anciennement EC 4.2.99.8). Pour la suite nous garderons le nom de cystéine synthase. Deux gènes codent pour cette enzyme : cysk (OASS A) et cysM (OASS B). CysK et CysM sont des CS isofonctionelles qui se retrouvent toutes les deux chez certains organismes comme chez E. coli K129, chez qui elles partagent 43 % d’identité de séquence, ou encore chez Salmonella typhimurium10. En outre, l’isoenzyme CysM est utilisée préférentiellement dans des conditions de croissance anaérobie10 et est capable d’utiliser le thiosulfate à la place du sulfure pour produire la S-sulfo-L-cystéine11 (figure 2). Chez E. coli par exemple, ces enzymes sont également impliquées dans la dégradation de la L-cystéine en H2S et pyruvate grâce à leur activité L-cystéine désulfhydrase (CD ; existe aussi sous le nom « desulfidase »), bien qu’il faille noter que l’activité CD y soit également catalysée par des enzymes issues d’au moins trois autres gènes. Chez d’autres organismes, on ne retrouve néanmoins qu’une seule de ces isoenzymes, comme c’est le cas chez Burkholderia cenocepiaceae où seul l’orthologue CysM a pu être identifié12.
Figure 2 : Voies de biosynthèse bactérienne de la L-cystéine et de la S-sulfocystéine via la sulfhydrylation de l’O-acétyl-L-sérine (modifié de Kredich et al., 2008).
Une variante de la voie de sulfhydrylation via la L-sérine activée a été décrite chez Mycobacterium tuberculosis et est présentée dans la figure 3. Bien qu’il était pensé initialement que le substrat physiologique de CysMtuberculosis (Uniprot ID : P9WP53) était l’OAS13, divers travaux ont par la suite montré que son substrat réel était la 3-phospho-L-sérine14,15, intermédiaire de la biosynthèse de la L-sérine et produit en 2 étapes à partir du 3-phosphoglycérate via SerA et SerC. En effet chez M. tuberculosis, où la voie classique de sulfhydrylation catalysée par CysE et CysK existe également, une voie alternative reposant sur CysM permet de former de la L-cystéine, en catalysant dans un premier temps : l’addition d’O-phosphosérine à l’extrémité C-terminale thiocarboxylate de la protéine CysO (CysO-COSH), une sulfur-carrier protéine similaire à ThisS et MoaD chez E. coli, générant ainsi le conjugué [CysO]-Gly-NH-CH2-C(O)-S-L-cystéine14. Puis dans un second temps, l’hydrolyse de ce conjugué par la carboxypeptidase Mec (Uniprot ID : P9WHS1), dont Burns et al. ont montré la dépendance au Zn2+, permet de libérer la L-cystéine13. Les sulfur-carrier protéines possèdent à leur extrémité C-terminale un motif Gly-Gly, dont le groupement carboxylate est d’abord adénylé puis sulfurylé par une sulfurylase afin de régénérer le thiocarboxylate CysO-C(O)SH. Dans le cas de CysO, ces deux étapes sont catalysées par la protéine bifonctionnelle [sulfur-carrier protéine CysO]-sulfur ligase, codée par le gène moeZ13. Quant aux deux CS CysK et CysM, elles sont organisées dans deux opérons distincts, l’un rassemblant cysK et cysE (Rv2334 et Rv2335 respectivement) et l’autre rassemblant les gènes mec, cysO et cysM (Rv1334, Rv1335 et Rv1336 respectivement).

Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ANNEXES
I INTRODUCTION
1.1 Voies de biosynthèse de la L-cystéine
1.1.1 Sulfhydrylation
1.1.1.1 Activation de la L-sérine
1.1.1.2 Cystéine synthases et régulation de la biosynthèse de la L-cystéine
1.1.2 Biosynthèse ARNt-dépendante de la cystéine, voie alternative
1.2 Voies de biosynthèse de la méthionine
1.2.1 Acylation de la L-homosérine
1.2.2 Biosynthèse de la L-homocystéine et voies d’incorporation du soufre
1.2.2.1 Voie de transsulfuration
1.2.2.2 Voie de sulfhydrylation directe
1.2.2.3 Problèmes d’annotation des enzymes de ces voies
1.2.3 Synthèse de la méthionine depuis l’homocystéine
1.3 Utilisation de la méthionine dans le métabolisme synthétique
1.3.1 Le cycle du méthyle activé (AMC) et ses dérivés
1.3.1.1 Cycle de la S-adénosylméthionine (SAM) ou cycle AdoMet
1.3.1.2 AdoMet (SAM) et le cycle de Yang : biosynthèse du 5′-Méthylthioadénosine (MTA), de polyamines
méthionine
1.3.2 Voies de recyclage de la L-méthionine et de la L-cystéine
1.3.2.1 Catabolisme de la L-cystéine en H2S
1.3.2.2 Voie de transsulfuration réverse et cystéine
1.3.2.3 Les voies de déméthylation/déméthiolation et méthanethiol
1.3.2.3.1 Etape I : synthèse du méthanethiol
1.3.2.3.2 Etape 2 : du méthanethiol au DMS
1.3.2.4 Catabolisme du DMS : vers la production de sulfites et d’H2S
1.3.2.5 Synthèse du DMSP à partir de la L-méthionine et catabolisme
1.4 A. baylyi ADP1, bactérie modèle
1.4.1 Des ressources génomiques et des outils pour l’étude du métabolisme d’ADP1
1.4.2 Biosynthèse de la méthionine chez ADP1
1.4.3 Biosynthèse de la L-cystéine
1.4.4 Sources alternatives du sulfate
II MATERIEL ET METHODES
2.1 Projet ADP1
2.1.1 Surexpression et purification des enzymes solubles de l’ORFéome
2.1.1.1 Transformation bactérienne
2.1.1.2 Induction à l’IPTG
2.1.1.3 Lyse cellulaire et dosage des protéines extraites
2.1.1.4 Purification His-Tag – chromatographie d’affinité
2.1.2 Construction du mutant de délétion ΔcysI essentiel sur sulfate
2.1.3 Phénotypage de la banque de mutants
2.1.3.1 Phénotypage complet en plaque 96 puits
2.1.3.2 Phénotypage en plaque Bioscreen
2.1.3.3 Synthèse du MTR à partir du MTA
2.1.4 Analyses spectrophotométriques
2.1.4.1 Détection de l’ammoniaque : test couplé à la glutamate déshydrogénase (GDH)
2.1.4.2 Test couplé à la GDH et détection de l’activité Met-TAM
2.1.4.3 Détection du pyruvate : test couplé à la lactate déshydrogénase (LDH)
2.1.5 Détection de l’activité cystathionine-β-synthase par LC-MS
2.1.6 Transcriptomique
2.1.6.1 Extraction des ARNs au TRIzol MAX
2.1.6.2 Traitement à la DNase TURBO
2.1.6.3 Purification et fractionnement des ARNs
2.2 Projet SAT/SST
2.2.1 Clonage et surexpression des SST
2.2.2 Activités O-acyl-CoA transférases
2.2.3 Synthèse chimique de l’O-succinyl-L-sérine (OSS)
2.2.4 Activité cystéine synthase
2.2.5 Détection de l’O-succinyl-L-sérine
2.2.5.1 Préparation du Métabolome
2.2.5.2 Analyse du métabolome
2.2.6 Construction des mutants des MetX de X. campestris en vue d’intervertir les activités HST et SST
III RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1 Projet SST
3.1.1 Description détaillée du groupe ASMC MetX-G3
3.1.2 Les MetX-HST2 fongiques (Cys2) sont-elles des SAT ou SST ?
3.1.3 L’acylation de la L-sérine est-elle répandue dans les familles MetX et MetA ?
3.1.4 Caractérisation de la L-sérine O-succinyltransférase de Schizosaccharomyces pombe et de son produit
enzymatique
3.1.4.1 Synthèse chimique du standard O-succinyl-L-sérine (OSS)
3.1.4.2 Validation in vitro de la formation du nouveau métabolite OSS
3.1.4.3 Paramètres cinétiques de Cys2 de S. pombe
3.1.4.4 L’OSS, un métabolite inédit impliqué dans la biosynthèse de la L-cystéine : validation in vivo chez
pomb
3.1.5 Analyse structurale des sites actifs des STT versus MetX-HST
3.1.6 Des L-sérine O-succinyltransférases chez les procaryotes ?
3.1.6.1 Validation in vitro de l’activité SST de diverses Xanthomonadales
3.1.6.2 Validation in vitro de la formation d’OSS
3.1.6.3 Paramètres cinétiques de MetX-HST2 de deux Xanthomonadales : Xanthomonas campestris et Frateuria
aurantia
3.1.6.4 Validation in vivo de la biosynthèse d’OSS chez X. campestris
3.1.7 SST et HST, deux activités intervertibles ?
3.1.7.1 Sélection des mutations en P9 du logo et constuction des mutants MetX HST et SST de X. campestris.
3.1.7.2 Caractérisation biochimiques des mutants MetX de X. campestris
3.1.8 Utilisation de l’OSS par les cystéine synthases
3.1.8.1 Paramètres cinétiques de la cystéine synthase Cys1a de S. pombe
3.1.8.2 Paramètres cinétiques des cystéine synthases de X. campestris et F. aurantia
3.1.8.3 Les SST forment elles un complexe avec la cystéine synthase ?
3.1.8.4 Capacité des cystéine synthases CysM et Cys1b à utiliser l’OSS
3.1.8.5 Comparaison avec CysK d’A. baylyi ADP1
3.1.9 SST impliquées dans la voie de biosynthèse de la D-cyclosérine
3.1.9.1 DcsE chez Streptomyces lavendulae
3.1.9.2 Biosynthèse de la cyclosérine chez des  et -protéobactéries
3.1.10 L’activité SST et le reste du vivant
3.2 Projet ADP1
3.2.1 Recherche des enzymes impliquées dans la transsulfuration réverse
3.2.1.1 Identification des enzymes à PLP d’ADP1
3.2.1.2 Tests d’activité CTT β-synthase (CBS)
3.2.1.3 Tests d’activité CTT ɣ-lyase (CGL)
3.2.2 Recherche des enzymes impliquées dans la voie de recyclage par phénotypage de la collection de mutants
3.2.3 Construction du mutant ΔCysI et vérification de l’hypothèse : la voie de recylage de la L-méthionine passe
production de H2S
3.2.3.1 Construction du mutant ΔcysI (ΔACIAD2982)
3.2.3.2 Phénotypage du mutant ΔcysI
3.2.4 Recyclage de la méthionine via le méthanesulfonate chez ADP1
3.2.4.1 Phénotypage des mutants ΔcysM, ΔcysI, ΔssuD
3.2.4.2 Conversion de la L-méthionine en méthanethiol
3.2.5 Etude du métabolisme de la méthionine chez ADP1 par une approche transcriptomique
3.2.5.1 Obtention des données de transcriptomique avec sulfate versus méthionine ou cystéine comme
de soufre.
3.2.5.2 Expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de la L-méthionine
3.2.5.3 Protéines SSI d’ADP1
3.2.5.4 Recherche d’un régulateur similaire à CysB
3.2.5.5 Corrélation entre source de soufre et métabolisme du fer chez ADP1
3.2.6 Recyclage de la L-méthionine via le DMSO puis le méthanesulfonate ?
3.2.6.1 Du Méthanethiol au DMS chez ADP1
3.2.6.2 Du DMSP au DMS
3.2.7 ADP1 et la diversité des sources de S assimilables
IV CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
PUBLICATION