Phéromones sexuelles chez les Mollusques non Céphalopodes.

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Contexte, problématique et objectifs

La seiche de Manche Sepia officinalis est un Mollusque Céphalopode qui constitue une ressource économique importante pour la région Normandie. Avec en moyenne 4000 à 7000 tonnes débarquées par an en criée (source : normandiefraicheurmer.fr) par les flottes hauturières et côtières, il s’agit de la quatrième ressource halieutique de la région en terme de tonnage. Ce stock est soumis à de fortes variations annuelles en raison notamment des conditions environnementales. L’espèce étant sémelpare, chaque génération assure successivement la pérennité de l’espèce sans jamais cohabiter avec les juvéniles. Un prélèvement excessif dans le stock de géniteurs ou une année de recrutement plus faible se traduit par une chute rapide du stock qui peut toutefois être compensée tout aussi rapidement par un bon recrutement. La seiche est donc une espèce fragile qui nécessite un suivi afin de préserver une ressource halieutique majeure des côtes normandes.
Si le suivi et l’évaluation des stocks de seiches constituent une approche incontournable dans une politique visant à préserver la ressource, l’étude des mécanismes régulateurs associés à la reproduction doit être réalisée en parallèle afin d’accéder à une compréhension globale des variations de stock. Grâce aux travaux réalisés dans notre équipe, il est aujourd’hui admis que la régulation de la ponte chez la seiche fait intervenir trois types de régulateurs : les neuropeptides étroitement associés à la perception des paramètres environnementaux, les peptides régulateurs ovariens opérant une synchronisation des différents organes constitutifs de l’appareil génital, et les phéromones sexuelles impliquées dans la stimulation de l’accouplement et la phase finale de l’émission des ovocytes mais aussi suspectées de faciliter le recrutement des géniteurs sur les aires de ponte côtières.
Les neuropeptides ont été les premiers régulateurs de ponte étudiés chez cette espèce. Leur identification a été réalisée sur la base de leur activité biologique au niveau des organes de l’appareil génital femelle. Ces peptides exprimés par le système nerveux central (SNC) modulent les contractions du tractus génital et des glandes annexes, participant respectivement au transport de l’ovocyte et à la sécrétion de la capsule. Ils sont par ailleurs suspectés de jouer un rôle dans la régulation de la vitellogénèse des follicules ovariens et dans la synthèse des
produits capsulaires (Henry and Boucaud-Camou, 1993). Depuis peu, les nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont rendu accessible l’acquisition massive de données transcriptomiques.
La réalisation de plusieurs transcriptomes de système nerveux de seiches mâles et femelles sexuellement matures est à l’origine de l’identification de l’ensemble du neuropeptidome (Zatylny-Gaudin et al, 2016). Des analyses in silico couplées à une approche peptidomique ont permis la sélection de familles de neuropeptides potentiellement impliquées dans la régulation de la ponte. À partir de critères basés sur le profil d’expression des transcrits et sur la localisation tissulaire des neuropeptides matures, deux familles de neuropeptides ont finalement été sélectionnées pour une exploration fonctionnelle et structurale : les Crustacean CardioActive Peptides (CCAPs) et les FLGamides.
Les CCAPs sont surexprimés dans le SNC des femelles en ponte versus des mâles matures. Cette surexpression est particulièrement marquée dans la masse sous-œsophagienne (MSSO). Cette région du SNC et en particulier le lobe palléovisceral situé en position postérieure innerve les viscères et l’appareil génital, et communique avec la seule aire neurohémale décrite chez la seiche. Par ailleurs, les 3 neuropeptides prédits à partir du précurseur protéique des CCAPs sont détectés dans les terminaisons nerveuses de la glande de l’oviducte et dans les glandes nidamentaires principales (GNP).
Les FLGamides ont été décrits pour la première fois chez la seiche Sepia officinalis (Zatylny-Gaudin et al., 2016). Tous les neuropeptides prédits à partir des deux précurseurs protéiques ont été identifiés en spectrométrie de masse. Ils sont présents dans l’ensemble de l’appareil génital et notamment dans le stroma ovarien, où ils sont les seuls neuropeptides à être détectés. Ils sont présents dans l’hémolymphe, ce qui permet de prédire un statut de neurohormones.
Un second type de régulateurs a été identifié chez S. officinalis : les peptides régulateurs ovariens, impliqués dans la régulation paracrine de l’appareil génital. Ils sont exprimés par les follicules ovariens et sont libérés dans la lumière de l’oviducte par les ovocytes. Ils sont impliqués dans la synchronisation du tractus génital et bloquent la libération des ovocytes pendant la période qui précède l’accouplement (Bernay et al., 2005, 2004). Enfin, ils sont à l’origine de la cyclisation des contractions de l’oviducte (Bernay et al., 2006a; Zatylny et al., 2000b, 2000c).
Les phéromones sexuelles constituent une troisième catégorie de régulateurs. Elles participeraient à la fois au recrutement des géniteurs sur les aires de ponte côtières, mais faciliteraient également l’accouplement et le déclenchement de la ponte.
Chez la seiche, trois transcrits présentant d’importantes homologies structurales ont été identifiés par Enault et al. (2012). Le clivage des précurseurs protéiques aboutit à la libération de peptides de masses moléculaires faibles à moyennes (1 à 8 kDa). Pour certains de ces peptides, des activités myotropes ont été démontrées sur les appareils génitaux mâles et femelles (Enault et al., 2012). Par ailleurs, l’existence de phéromones de masse moléculaire plus élevée telles que celles décrites chez l’aplysie, espèce migratrice de faible amplitude se reproduisant à la côte, est fortement suspectée chez la seiche normande, espèce migratrice de moyenne amplitude se reproduisant sur des aires de ponte côtières.
Cette thèse s’inscrit donc dans la continuité des travaux initiés dans l’unité et dont l’objectif est l’étude des mécanismes régulateurs impliqués dans le contrôle de la ponte. Grâce aux nouveaux outils d’investigation que sont le séquençage haut débit (RNAseq de novo Illumina) permettant la construction de transcriptomes et les approches peptidomiques/protéomiques, les volets fonctionnel et structural sont explorés en parallèle.

Table des matières

Introduction générale
I. Contexte, problématique et objectifs.
II. Le modèle Sepia officinalis
A. Généralités
B. Anatomie.
1. Anatomie générale
2. Le système nerveux central.
3. L’appareil reproducteur.
a. Les organes génitaux femelles
b. Les organes génitaux mâles
4. L’appareil circulatoire
5. L’organe olfactif
C. Cycle de vie de la seiche de Manche.
D. Reproduction.
1. L’ovogénèse
2. L’accouplement
3. La ponte
E. Comportement
III. Peptides et polypeptides régulant la ponte
A. Introduction
B. Les neuropeptides
1. Présentation générale
2. Les neuropeptides chez les Mollusques
C. Les régulateurs ovariens
1. Régulation paracrine chez les Mollusques
2. Régulation paracrine chez la seiche.
D. Les phéromones sexuelles.
1. Présentation générale
2. Les phéromones sexuelles.
3. Phéromones sexuelles chez les Insectes
4. Phéromones sexuelles chez les Mammifères
5. Phéromones sexuelles chez les Mollusques non Céphalopodes.
6. Phéromones sexuelles chez les Céphalopodes.
IV. Approches expérimentales
Matériels et méthodes
I. Matériel Biologique
A. Animaux.
B. Prélèvements de matériel biologique
II. Approche transcriptomique.
A. Extraction d’ARN
B. Séquençage et création d’une banque de transcrits
C. Analyses in silico
III. Approche peptidomique
A. Extractions.
1. Extraction de neuropeptides.
2. Extraction de phéromones à partir de la GOVI et des capsules d’oeufs
3. Extraction de phéromones à partir d’eau d’incubation d’oeufs
B. Purification.
1. Chromatographie Liquide Haute performance en phase inverse (rpHPLC)
a. Purification de phéromones du milieu d’incubation des oeufs.
b. Purification de capsules internes et externes
c. Purification de phéromones de GOVI.
2. Nano-LC-MALDI-TOF/TOF
C. Réduction, alkylation et digestion trypsique
D. Spectrométrie de masse.
E. Séquençage d’Edman
IV. Production de la phéromone β en système recombinant..
A. Transformation bactérienne.
B. Contrôle de l’intégration du plasmide par PCR.
C. Production en système recombinant
D. Extraction et purification de la phéromone β recombinante.
E. Dosage Bradford et gel SDS-PAGE.
1. Dosage Bradford
2. Gel SDS-PAGE
V. Cartographie tissulaire en immunocytochimie
A. Préparation des échantillons
B. Immunocytochimie
C. Contre-coloration au Trichrome de Prenant-Gabe
D. Observations microscopiques
VI. Synthèse peptidique
VII. Caractérisation fonctionnelle
A. Analyses ex vivo.
B. Tests comportementaux
VIII. Analyses structurales en RMN et CD
Partie I : Caractérisation structurale et fonctionnelle de deux familles de neuropeptides impliquées dans le contrôle de la ponte
I. Introduction
II. Crustacean Cardioactive Peptides
III. Neuropeptides FLGamides
IV. Conclusion
Partie II : Caractérisation de phéromones sexuelles et production en système recombinant
I. Introduction.
A. Phéromones sexuelles, ponte et reproduction
B. Phéromones sexuelles chez le genre Aplysia
C. Phéromones sexuelles chez Sepia officinalis
D. Objectifs
II. Résultats et discussion.
A. Caractérisation structurale des précurseurs SP
1. À partir de la glande de l’oviducte.
2. À partir des capsules d’oeufs
3. À partir de l’eau d’incubation des oeufs
4. À partir de l’eau d’incubation des oeufs fractionnée en rpHPLC
B. Recherche de récepteurs candidats à la liaison des phéromones sexuelles
C. Production de la phéromone β et tests fonctionnels.
III. Conclusions et perspectives
Conclusion générale et perspectives.
Références bibliographiques.